一种利用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性的方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性的方法，具体地，本发明提供了一种HER2拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：用于检测HER2基因的两对引物，和用于检测选自下组的内参基因的一对或多对引物：CEP17、EFTUD2，或其组合。本发明采用ddPCR技术结合多内参基因进行组合的方式，可以有效地判断出常规方法只能判定为疑似阳性的样本是否存在HER2阳性，从而辅助指导乳腺癌用药。
【专利说明】
-种利用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及指导肿瘤治疗的分子检测技术领域，具体是涉及一种利用ddPCR技术 检测乳腺癌HER2阳性的方法。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌已成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤，是一种严重影响妇女身心健康甚 至危及生命的最常见的疾病之一。不同分子分型的患者对临床治疗的反应及预后可能会有 很大差别。
[0003] 人类表皮生长因子受体_2(HER2)是由HER2(又称为ERBB2或NEU)原癌基因编 码的具有受体酪氨酸激酶（RTK)活性的跨膜糖蛋白，能启动酪氨酸激酶调控的信号转导系 统。HER2基因扩增及蛋白的过度表达会过度传递信号，刺激癌细胞增殖。HER2是乳腺癌分 型的一个主要指标，20%~30%的乳腺癌患者罹患的是具有"黑蝴蝶"之称的HER2阳性乳 腺癌，浸润性强，无病生存期短，预后差。测定HER2在乳腺癌患者的肿瘤中是否存在过度表 达对于患者的预后判断、治疗方案的选择具有重要意义，能够极大地提升治疗的安全有效 性，增加治疗费效比。目前医学界已经达成共识，生物靶向治疗是HER2阳性乳腺癌的一种 有效治疗手段。
[0004] 赫赛汀（Herceptin，曲妥珠单抗）是一种针对HER2原癌基因产物的单克隆抗体， 是唯一被美国FDA批准用于治疗转移性乳腺癌和早期乳腺癌的HER2靶向药物，已被广泛应 用于各期HER2阳性乳腺癌的治疗。赫赛汀能选择性地作用于HER2受体胞外段，干扰HER2 与其它ErbB家族成员形成异源二聚体，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡。经中 国食品药品监督管理局的批准，赫赛汀作为HER2过度表达晚期乳腺癌患者的一线治疗方 案。
[0005] 目前临床实验室只有免疫组化（IHC)和荧光原位杂交（FISH)技术被广泛应用于 检测手术切除标本HER2蛋白或基因状态。IHC检测结果为0或1+者即可判定HER2表达 阴性，不适合使用Her2靶向药物；IHC 3+者即判定HER2表达阳性，适用Her2靶向药物；而 IHC 2+者需要再进一步应用FISH进行HER2基因扩增检测。IHC技术检测的是HER2蛋白 层面的表达，检测过程的人为影响因素较多，导致准确性和可重复性较差，从而影响患者的 治疗用药选择。利用FISH技术从基因水平上进行检测是Her2阳性检测的"金标准"。通过 计算HER2基因探针与17号染色体着丝粒（CEP17)探针杂交信号之比来判断HER2基因是 否有扩增，将检测结果小于的1. 8定位为HER2阴性，检测结果大于2. 2定位阳性，而检测结 果为1. 8-2. 2之间的则无法准确界定，为疑似阳性。对于HER2阳性患者，可以使用HER2靶 向药物，如赫赛汀等；而HER2阴性患者，则不推荐使用这类药物。
[0006] 然而目前这些检测方法都存在很大的不足，IHC检测HER2蛋白过度表达的错误率 平均为18%，FISH检测HER2基因扩增的错误率在13%。近来有研究发现，一些HER2疑似 阳性患者，以及部分HER2阴性患者也对HER2靶向药物敏感，认为根据IHC或FISH法检测 结果指导用药并不十分准确。因此需要一种更灵敏更准确的HER2阳性/阴性乳腺癌检测 方法，以指导患者对HER2靶向药物的使用，使更多的患者受益。
[0007] 综上所述，本领域尚缺乏一种能够准确有效地检测HER2突变阳性的方法。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种能够准确有效地检测HER2突变阳性的方法。
[0009] 本发明的第一方面，提供了一种HER2拷贝数变异检测试剂盒，所述的试剂盒包 括：用于检测HER2基因的两对引物，和用于检测选自下组的内参基因的一对或多对引物： CEP17、EFTUD2,或其组合。
[0010] 在另一优选例中，所述的试剂盒包括用于检测CEP17基因的一对引物。
[0011] 在另一优选例中，所述的试剂盒包括用于检测EFTUD2基因的2对引物。
[0012] 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的探针：用于检测HER2基因的探 针、用于检测CEP17基因的探针、用于检测EFTUD2基因的探针。
[0013] 在另一优选例中，所述的探针为VIC探针或FAM探针。
[0014] 在另一优选例中，所述的用于检测HER2基因的两对引物对的序列如SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID N0:2,或 SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5 所示。
[0015] 在另一优选例中，所述的用于检测CEP17基因的引物对的序列如SEQ ID N0:13和 SEQ ID NO: 14 所示。
[0016] 在另一优选例中，所述的用于检测EFTUD2基因的两对引物对的序列如SEQ ID N0:SEQIDN0:7和SEQIDN0:8，或SEQIDN0:10和SEQIDN0:11所示。
[0017] 在另一优选例中，所述的用于检测HER2基因的探针的序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID N0:6所示；优选地，所述的探针为FAM探针。
[0018] 在另一优选例中，所述的用于检测CEP17基因的探针的序列如SEQ ID N0:15所 示；优选地，所述的探针为VIC探针。
[0019] 在另一优选例中，所述的用于检测EFTUD2基因的探针的序列如SEQ ID N0:9和 SEQ ID NO: 12所示；优选地，所述的探针为VIC探针。
[0020] 在另一优选例中，所述试剂盒包括：
[0021] (a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含HER2基因的特异引物 对；
[0022] (b)第二容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含HER2基因的特异引物 对；
[0023] (c)第三容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含CEP17基因的特异引物 对；
[0024] (d)第四容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含EFTUD2基因的特异引物 对；
[0025] (e)第五容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含EFTUD2基因的特异引物 对；
[0026] (f)使用说明书（如插页），其中，所述说明书记载了使用方法。
[0027] 在另一优选例中，所述的使用方法包括：（1)提供一检测样本，所述的检测样本是 肿瘤组织样本；
[0028] (2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物；
[0029] (3)以步骤（2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR (ddPCR)，从而获 得含HER2基因和内参基因的扩增产物；和
[0030] (4)对所述扩增产物进行分析，从而得出HER2基因和内参基因的突变形式和/或 比例；
[0031] 其中，所述的内参基因是CEP 17和EFTUD2。
[0032] 在另一优选例中，在所述步骤（2)中，对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽 提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液。
[0033] 在另一优选例中，在步骤（3)中，所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为50~ 100ng〇
[0034] 在另一优选例中，所述的方法是非诊断且非治疗性的。
[0035] 在另一优选例中，所述的方法还包括：对HER2基因进行两组扩增，且所述的扩增 是用不同的引物对进行的。
[0036] 在另一优选例中，所述的方法还包括：对EFTUD2基因进行两组扩增，且所述的扩 增是用不同的引物对进行的。
[0037] 本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的试剂盒的用途，其特征 在于，用于制备：（a)用于检测或判断肿瘤患者是否对赫赛汀敏感的试剂盒；(b)用于判断 肿瘤患者是否适合使用或继续使用赫赛汀进行治疗的试剂盒；（c)用于检测或判断肿瘤患 者是否对赫赛汀敏感。
[0038] 在另一优选例中，所述的肿瘤患者包括乳腺癌患者。
[0039] 在另一优选例中，所述的肿瘤患者为人。
[0040] 在另一优选例中，所述是检测包括在给予赫赛汀之前、之中、或之后进行检测。
[0041] 本发明的第三方面，提供了一种样本中HER2突变阳性检测方法，所述方法包括：
[0042] (1)提供一检测样本，所述的检测样本是肿瘤组织样本；
[0043] (2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物；
[0044] (3)以步骤（2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR (ddPCR)，从而获 得含HER2基因和内参基因的扩增产物；和
[0045] (4)对所述扩增产物进行分析，从而得出HER2基因和内参基因的突变形式和/或 比例；
[0046] 其中，所述的内参基因是CEP 17和EFTUD2。
[0047] 在另一优选例中，在所述步骤（2)中，对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽 提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液。
[0048] 在另一优选例中，在步骤⑶中，所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为50~ 100ng〇
[0049] 在另一优选例中，所述的方法是非诊断且非治疗性的。
[0050] 在另一优选例中，所述的方法还包括：对HER2基因进行两组扩增，且所述的扩增 是用不同的引物对进行的。
[0051] 在另一优选例中，所述的方法还包括：对EFTUD2基因进行两组扩增，且所述的扩 增是用不同的引物对进行的。
[0052] 在另一优选例中，在ddPCR中，反应体系中还含有用于检测HER2基因和内参基因 的探针。
[0053] 在另一优选例中，所述的探针为FAM探针或HEX探针。
[0054] 在另一优选例中，所述的用于检测HER2基因的两对引物对的序列如SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID N0:2,或 SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5 所示。
[0055] 在另一优选例中，所述的用于检测CEP17基因的引物对的序列如SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14 所示。
[0056] 在另一优选例中，所述的用于检测EFTUD2基因的两对引物对的序列如SEQ ID N0:SEQIDN0:7和SEQIDN0:8，或SEQIDN0:10和SEQIDN0:11所示。
[0057] 在另一优选例中，所述的用于检测HER2基因的探针的序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID N0:6所示；优选地，所述的探针为FAM探针。
[0058] 在另一优选例中，所述的用于检测CEP17基因的探针的序列如SEQ ID N0:15所 示；优选地，所述的探针为VIC探针。
[0059] 在另一优选例中，所述的用于检测EFTUD2基因的探针的序列如SEQ ID N0:9和 SEQ ID NO: 12所示；优选地，所述的探针为VIC探针。
[0060] 在另一优选例中，所述的PCR反应的反应体系包括：待测基因组50~100ng， 2XddPCR SuperMix for Probes(Bio_Rad 1^13〇抑1:〇1^68)10以1，引物对上下游各1以1，及 探针1 μ 1，无菌蒸馏水补足至20 μ 1 ;其中，所述的引物对选自下组：HER-2引物对HI、H2， 内参基因 CEP17引物对C1、内参基因 EFTUD2引物对El和E2。
[0061] 在另一优选例中，所述的样本来自于选自下组的检测对象：乳腺癌患者。
[0062] 在另一优选例中，所述的肿瘤组织包括：新鲜组织、和石蜡包埋组织。
[0063] 在另一优选例中，在所述步骤（2)中，所述的抽提处理包括步骤：
[0064] (i)提供一组织样本；
[0065] (ii)对所述样本进行溶解，优选地，加入蛋白酶K对所述样本进行溶解，得到样本 溶解液；
[0066] (iii)对所述的样本溶解液进行离心，得到抽提的基因组DNA。
[0067] 在另一优选例中，当所述的组织为新鲜组织时，所述步骤（iii)中，所述的离心包 括：
[0068] (iii-Ι)将样本溶解液倒入吸附柱中，在第一离心管中11000_13000rpm离心 10-50秒，倒去收集管中废液；
[0069] (iii-2)向吸附柱内加入缓冲液，在第一离心管中11000-13000rpm离心10-50秒， 倒掉收集管中废液；
[0070] (iii-3)向吸附柱内加入漂洗液，在第一离心管中11000-13000rpm，离心10-50 秒，倒掉收集管中废液，并重复一次；
[0071] (iii-4)空转 11000-13000rpm，1-3 分钟；
[0072] (iii-5)将吸附柱放入第二离心管中，向吸附膜中间加入30-70 μ 1的缓冲液TE， 室温孵育1-3分钟，11000-13000rpm离心1-3分钟，得到抽提的基因组DNA。
[0073] 在另一优选例中，当所述的组织为石蜡包埋组织时，所述步骤（iii)中，所述的离 心包括：
[0074] (iii-1)将样本溶解液倒入吸附柱中，在第一离心管中6000-10000rpm离心0· 5-2 分钟，倒去收集管中废液；
[0075] (iii-2)向吸附柱内加入500 μ1缓冲液，在第一离心管中6000-10000rpm离心 0. 5-2分钟，倒掉收集管中废液，再重复两次；
[0076] (iii-3)空转 11000-13000rpm，1-3 分钟；
[0077] (iii-4)将吸附柱放入第二离心管中，向吸附膜中间加入30-70 μ 1的缓冲液TE， 室温孵育1-3分钟，11000-13000rpm离心1-3分钟，得到抽提的基因组DNA。
[0078] 在另一优选例中，所述步骤（2)中PCR反应条件为：95°C变性lOmin ;随后94°C变 性30sec，60°C退火60sec，进行40个循环；最后98°C延伸lOmin，4°C保存。
[0079] 在另一优选例中，所述的步骤（4)包括：分析所述HER-2引物对Hl、H2,内参基因 CEP17引物对C1、内参基因 EFTUD2引物对E1和E2扩增产物的拷贝数，并用HER-2基因拷 贝数去除以内参基因拷贝数，得到六组比值，即Hl/Cl，Hl/El，H1/E2, H2/C1，H2/E1，H2/E2， 若六个比值均小于等于2. 0,则判定为Her2阴性，若六个比值中有1个大于2. 0,则判定为 Her2阳性。
[0080] 在另一优选例中，所述方法具有以下的灵敏度：从10万个正常DNA分子中检测到 一个HER2突变分子。
[0081] 在另一优选例中，所述的方法还包括：对来自于同一检测对象的外周血浆进行 ddPCR检测，得到其mRNA表达和DNA拷贝数变异。
[0082] 本发明的第四方面，提供了一种肿瘤患者赫赛汀耐药性的检测方法，包括步骤：用 如本发明第三方面所述的方法进行HER2阳性检测；和
[0083] 若检测结果为阳性，则判定患者对赫赛汀敏感，可以对其使用赫赛汀治疗；若检测 结果为阴性，则判定患者对赫赛汀耐药，不适合使用赫赛汀治疗。
[0084] 在另一优选例中，所述的肿瘤患者为乳腺癌患者。
[0085] 在另一优选例中，所述的耐药为原发性耐药或继发性耐药。
[0086] 本发明的第五方面，提供了一种肿瘤患者治疗方法，所述方法包括步骤：
[0087] (a)用如本发明第三方面所述的方法，对所述对象进行HER2阳性检测，并对检测 结果为阳性的对象，采用HER2靶向药物进行治疗。
[0088] 在另一优选例中，所述的肿瘤患者为乳腺癌患者。
[0089] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0090] 图1是实施例中样本1的ddPCR仪拷贝数结果显示。图中纵坐标为目的基因拷贝 数浓度（copies/μ 1)，横坐标为对应所检测的基因，每个点的误差线表示95%置信区间。 Η1，Η2为基因 Her2的两组引物探针（蓝色框）；C1为的引物探针（绿色框）；Ε1，Ε2为基因 CEP17基因 EFTUD的两组引物探针（绿色框）。
[0091] 图2是实施例中样本2的ddPCR仪拷贝数结果显示。图中纵坐标为目的基因拷贝 数浓度（copies/μ 1)，横坐标为对应所检测的基因，每个点的误差线表示95%置信区间。 Hl，H2为基因 Her2的两组引物探针（蓝色框）；C1为基因 CEP17的引物探针（绿色框）； El，E2为基因 EFTUD的两组引物探针（绿色框）。
【具体实施方式】
[0092] 本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，采用ddPCR扩增技术，并使用 CEP17和EFTUD2共同作为内参基因，从而对HER2阳性突变进行检测的方式，能够极大程度 地排除假阴性的情况，从而确证一些常规方法中疑似突变阳性的患者是否存在HER2阳性。 基于上述发现，发明人完成了本发明。
[0093] 本发明的目的是提供一种用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性的方法。
[0094] 本发明的另一目的是提供乳腺癌HER2阳性的判定方法。
[0095] 本发明的最终目的是通过ddPCR技术，检测乳腺癌患者肿瘤组织中HER2基因拷贝 数与内参基因 CEP17和EFTUD2基因拷贝数，再根据HER2和内参基因拷贝数的比值判定该 乳腺癌患者是否为HER2阳性，指导患者对HER2靶向药物的使用。
[0096] HER2基因阳性检测
[0097] 数字PCR (digital PCR，dPCR)技术被称为"第三代PCR"技术，是一项检测和定量 核酸分子的新技术，在不依靠任何校准物或外标的情况下，可直接进行单个目标分子的计 数，以实现绝对定量。微滴式数字PCR系统（droplet digital PCR，ddPCR)将含有核酸分 子的反应体系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴不含或者含有一个至数个带有目标 基因突变的DNA片段。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行荧光检测，因此具有极高的灵敏 度，能用于检测样品中含量极低的DNA拷贝。与传统PCR、定量PCR相比，其结果的精确度、 准确性和灵敏度更佳。该技术能够确认拷贝数极低的待检靶分子的绝对数目，特别适合拷 贝数变异、热点突变和基因相对表达等方面的检测。
[0098] 在本发明中，利用ddPCR技术检测肿瘤组织中HER2基因拷贝数，并将其与17号染 色的内参基因（CEP17和EFTUD2)进行比较，可以更精确的得出HER2基因扩增情况，更灵敏 的界定HER2阳性乳腺癌患者，为乳腺癌患者提供更准确的靶向药物用药指导。
[0099] 本发明运用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性的方法包括如下步骤：
[0100] (1)提供一检测样本，所述的检测样本是肿瘤组织样本；
[0101] (2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物；
[0102] (3)以步骤（2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR (ddPCR)，从而获 得含HER2基因和内参基因的扩增产物；和
[0103] (4)对所述扩增产物进行分析，从而得出HER2基因和内参基因的突变形式和/或 比例；其中，所述的内参基因是CEP 17和EFTUD2。
[0104] 在另一优选例中，在所述步骤⑵中，对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽 提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/微升的提取液。
[0105] 本发明的方法可以在DNA模板量较低的情况下完成扩增，在另一优选例中，在步 骤（3)中，所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为50~100ng。
[0106] 在所述的PCR中，各引物对可以选用针对特定目标序列进行扩增的引物对。在另 一优选例中，所述的方法中，对HER2基因进行两组扩增，且所述的扩增是用不同的引物对 进行，针对不同的目标序列。
[0107] 在另一优选例中，所述的方法中，对EFTUD2基因进行两组扩增，且所述的扩增是 用不同的引物对进行，针对不同的目标序列。
[0108] 在另一优选例中，所述的用于检测HER2基因的两对引物对的序列如SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID N0:2,或 SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5 所示所示。
[0109] 在另一优选例中，所述的用于检测CEP17基因的引物对的序列如SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14 所示。
[0110] 在另一优选例中，所述的用于检测EFTUD2基因的两对引物对的序列如SEQ ID N0:7 和 SEQ ID N0:8,或 SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 所示。
[0111] 在另一优选例中，在所述的ddPCR中，所述的反应体系中还含有用于检测HER2基 因和内参基因的探针。所述探针的种类没有特别的限制，在另一优选例中，所述的探针为 FAM探针或VIC探针。
[0112] 在另一优选例中，所述的用于检测HER2基因的探针的序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:6所示；优选地，所述的探针为FAM探针。
[0113] 在另一优选例中，所述的用于检测CEP17基因的探针的序列如SEQ ID N0:15所 示；优选地，所述的探针为VIC探针。
[0114] 在另一优选例中，所述的用于检测EFTUD2基因的探针的序列如SEQ ID N0:9和 SEQ ID NO: 12所示；优选地，所述的探针为VIC探针。
[0115] 在另一优选例中，所述的PCR反应的反应体系包括：待测基因组50~100ng， 2 X ddPCR SuperMix for Probes (Bio-Rad Laboratories) 10 μ 1，引物对及探针共 1 μ 1， 无菌蒸馏水补足至20μ1 ;其中，所述的引物对选自下组：HER-2引物对Hl、Η2,内参基因 CEP17引物对C1、内参基因 EFTUD2引物对E1和E2。
[0116] 所述的样本优选地为来自于乳腺癌患者的样本，当所述的样本来自于乳腺癌患者 时，所述的方法还可以用于辅助判断该患者是否对于赫赛汀敏感。
[0117] 在另一优选例中，所述的肿瘤组织包括：新鲜组织、和石蜡包埋组织。
[0118] 在另一优选例中，在所述步骤（2)中，所述的抽提处理包括步骤：（i)提供一组织 样本；
[0119] (ii)对所述样本进行溶解，优选地，加入蛋白酶K对所述样本进行溶解，得到样本 溶解液；
[0120] (iii)对所述的样本溶解液进行离心，得到抽提的基因组DNA。
[0121] 在另一优选例中，当所述的组织为新鲜组织时，所述步骤（iii)中，所述的离心包 括：
[0122] (iii-Ι)将样本溶解液倒入吸附柱中，在第一离心管中11000_13000rpm离心 10-50秒，倒去收集管中废液；
[0123] (iii-2)向吸附柱内加入缓冲液，在第一离心管中11000-13000rpm离心10-50秒， 倒掉收集管中废液；
[0124] (iii-3)向吸附柱内加入漂洗液，在第一离心管中11000-13000rpm，离心10-50 秒，倒掉收集管中废液，并重复一次；
[0125] (iii-4)空转 11000-13000rpm，1-3 分钟；
[0126] (iii-5)将吸附柱放入第二离心管中，向吸附膜中间加入30-70 μ 1的缓冲液TE， 室温孵育1-3分钟，11000-13000rpm离心1-3分钟，得到抽提的基因组DNA。
[0127] 在另一优选例中，当所述的组织为石蜡包埋组织时，所述步骤（iii)中，所述的离 心包括：
[0128] (iii-Ι)将样本溶解液倒入吸附柱中，在第一离心管中6000-10000rpm离心0. 5-2 分钟，倒去收集管中废液；
[0129] (iii-2)向吸附柱内加入500 μ1缓冲液，在第一离心管中6000-10000rpm离心 0. 5-2分钟，倒掉收集管中废液，再重复两次；
[0130] (iii-3)空转 11000-13000rpm，1-3 分钟；
[0131] (iii-4)将吸附柱放入第二离心管中，向吸附膜中间加入30-70 μ 1的缓冲液TE， 室温孵育1-3分钟，11000-13000rpm离心1-3分钟，得到抽提的基因组DNA。
[0132] 优选的抽提处理包括步骤：
[0133] 新鲜组织抽提：将组织样本置于冰上，剪取米粒大小组织样本放入1. 5ml离心管， 并用手术刀尽可能的剪碎。加入200 μ 1缓冲液和20 μ 1蛋白酶K溶液，56°C水浴2小时以 上直至组织溶解。加入200 μ 1缓冲液，充分颠倒混匀，70°C水浴10分钟。加200 μ 1的无水 乙醇，充分震荡15秒。将所有的溶液和沉淀都倒入吸附柱中，12000rpm离心30秒，倒去收 集管中废液。向吸附柱内加入500 μ 1的缓冲液，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中废液。 向吸附柱内加入700 μ 1的漂洗液，12000rpm，离心30秒，倒掉收集管中废液，并重复一次。 空转12000rpm 2分钟，将吸附柱放入新的1. 5ml离心管中，向吸附膜中间加入50 μ 1的缓 冲液ΤΕ，室温孵育2分钟，12000rpm离心2分钟，离心管中的液体即为抽提的基因组DNA。
[0134] 石蜡包埋组织抽提：将5-8片10 μ m厚的组织切片样品刮入1. 5ml离心管，加入 lml二甲苯，振荡2min，12000rpm，4°C的条件下离心2min，弃上清。再加入lml无水乙醇，振 荡2min，12000rpm，4°C的条件下离心2min，弃上清，再重复洗涤1次。37°C干燥10_15min，至 酒精完全挥发。加入200 μ1缓冲液和20μ1蛋白酶K溶液，混匀。56°C水浴2h以上，直至 样品完全溶解，再于90°C水浴lh。加入220 μ 1缓冲液，250 μ 1无水乙醇，震荡混匀。将所 有的溶液倒入吸附柱中，8000rpm离心1分钟，倒去收集管中废液。向吸附柱内加入500 μ 1 缓冲液，8000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，再重复两次。空转12000rpm 2分钟，将 吸附柱放入新的1. 5ml离心管中，向吸附膜中间加入50 μ 1的缓冲液TE，室温孵育2分钟， 12000rpm离心2分钟，离心管中的液体即为抽提的基因组DNA。
[0135] 在另一优选例中，所述步骤（2)中PCR反应条件为：95°C变性lOmin ;随后94°C变 性30sec，60°C退火60sec，进行40个循环；最后98°C延伸lOmin，4°C保存。
[0136] 所述扩增产物的分析可以采用对HER2扩增产物和内参基因扩增产物的含量进行 比较的方式。一般而言，该比值多2.0即为突变阳性。常规方法中，由于测定结果浮动幅度 较大，一般设定为该比值多2. 2时判断出现HER2阳性，< 1. 8时为阴性，在上述两端点范围 内则为疑似阳性。而本申请方法由于测定结果浮动幅度非常小（一般< ±0. 02)，故可以依 据本申请方法测定的比值，对上述属于疑似阳性范围内的样本进行准确的判断。在另一优 选例中，所述的步骤（4)包括：分析所述HER-2引物对H1、H2,内参基因 CEP17引物对C1、内 参基因 EFTUD2引物对E1和E2扩增产物的拷贝数，并用HER-2基因拷贝数去除以内参基因 拷贝数，得到六组比值，即Hl/Cl，Hl/El，H1/E2, H2/C1，H2/E1，H2/E2,若六个比值均小于等 于2. 0,则判定为Her2阴性，若六个比值中有1个大于2. 0,则判定为Her2阳性。
[0137] 在另一优选例中，所述方法具有以下的灵敏度：从10万个正常DNA分子中检测到 一个HER2突变分子。
[0138] 本发明的方法优选地还可以与其他HER2突变检测方法进行结合，从而进一步提 高疑似阳性范围内的样本的判断准确度。例如，在本发明的一个优选实施方式中，所述的方 法还包括：对来自于同一检测对象的外周血浆进行ddPCR检测，得到其mRNA表达和DNA拷 贝数变异。
[0139] 本发明一种特别优选的实施方式中，所述的扩增包括步骤：
[0140] (1)提取乳腺癌患者肿瘤组织基因组DNA。
[0141] (2)实验所用引物包括H1、H2、C1、E1、E2共5对引物。其中H1和H2扩增目的片 段对应为HER2基因片段，C1扩增目的片段为CEP17基因片段，E1和E2扩增目的片段对应 为EFTUD2基因片段。C1、E1、E2引物对所扩增片段作为内参基因片段。所有探针类型均为 VIC或FAM探针。
[0142] (3)进行ddPCR反应。每个待测样本同时进行5组PCR反应，每组PCR反应用H1、 H2、C1、E1、E2中的1对引物。
[0143] a. 20 μ 1 PCR 反应体系如下：待测肿瘤组织 DNA 50 ~100ng，2XddPCR SuperMix for Probes(Bio_Rad Laboratories)10yl，HER2 基因或者内参基因引物上下游各 ΙμL， HEX探针1 μ 1，无菌蒸馏水补足至20 μ 1 ;
[0144] b.将含有样品的DNA反应液通过QX100微滴发生器（Bio-Rad Laboratories，USA) 生成纳升级别的油包水的液滴；
[0145] c. PCR反应条件为：95°C变性lOmin ;随后94°C变性30sec，60°C退火60sec，进行 40个循环；最后98°C延伸lOmin，4°C保存；
[0146] d. PCR反应结束后，将PCR板转移到QX100微滴分析仪（Bio-Rad Laboratories， USA)对所有样品孔进行荧光检测。
[0147] (4)结果分析
[0148] 实验中共用了 5组引物，分别是HER-2引物H1和H2,内参引物C1、E1和E2。通过 ddPCR得出每个标本对应每对引物的拷贝数，然后用HER-2基因拷贝数去除以内参基因拷 贝数，得到六组比值，即Hl/Cl，Hl/El，H1/E2, H2/C1，H2/E1，H2/E2。根据比值结果，六个比 值均小于等于2. 0,则判定该患者乳腺癌为Her2阴性，若六个比值中有1个大于2. 0,则为 Her2阳性。
[0149] 本发明相对于现有技术，有以下优点：
[0150] (1)本发明的检测方法具有较高的灵敏度（0. 001% )(即可以从10万个正常DNA 分子中检测到一个突变分子的存在），仅需使用l〇〇ng的DNA模板即可完成检测。
[0151] (2)本发明的方法采用两组内参基因的方式进行，从而有效地排除了由于CEP17 扩增导致的假阴性结果，因此相较于现有技术中仅以CEP17作为内参的方案具有更高的准 确性。
[0152] (3)在本领域中，常规的突变标准为待测基因拷贝数/内参基因拷贝数多2.2， 但由于本发明方法具有很好的扩增灵敏度，检测结果稳定，因此可以对于HER2疑似阳性 (FISH检测结果1. 8-2. 2之间）的患者进行定性检测。
[0153] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0154] 各实施例中，引物和探针序列如下：
[0173] 实施例1利用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性
[0174] (1)提取乳腺癌患者肿瘤组织基因组DNA ;
[0175] 将组织样本置于冰上，剪取米粒大小组织样本放入1. 5ml离心管，并用手术刀尽 可能的剪碎。加入200 μ 1缓冲液和20 μ 1蛋白酶K溶液，56°C水浴2小时以上直至组织溶 解。加入200 μ 1缓冲液，充分颠倒混勾，70°C水浴10分钟。加200 μ 1的无水乙醇，充分震 荡15秒。将所有的溶液和沉淀都倒入吸附柱中，12000rpm离心30秒，倒去收集管中废液。 向吸附柱内加入500 μ 1的缓冲液，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中废液。向吸附柱内加 入700 μ 1的漂洗液，12000rpm，离心30秒，倒掉收集管中废液，并重复一次。空转12000rpm 2分钟，将吸附柱放入新的1. 5ml离心管中，向吸附膜中间加入50 μ 1的缓冲液TE，室温孵 育2分钟，12000rpm离心2分钟，离心管中的液体即为抽提的基因组DNA。
[0176] (2)进行PCR扩增。每个待测样本同时进行5组PCR反应，每组PCR反应用H1、H2、 C1、E1、E2中的1对引物。
[0177] a. 20 μ 1 PCR 反应体系如下：待测肿瘤组织 DNA 50 ~100ng，2 X ddPCR SuperMix for Probes(Bio_Rad Laboratories)10yl，HER2 基因或者内参基因引物上下游各 ΙμL， HEX探针1 μ 1，无菌蒸馏水补足至20 μ 1 ;
[0178] b.将含有样品的DNA反应液通过QX100微滴发生器（Bio-Rad Laboratories，USA) 生成纳升级别的油包水的液滴；
[0179] c. PCR反应条件为：95°C变性lOmin ;随后94°C变性30sec，60°C退火60sec，进行 40个循环；最后98°C延伸lOmin，4°C保存；
[0180] cL PCR反应结束后，将PCR板转移到QX100微滴分析仪（Bio-Rad Laboratories， USA)对所有样品孔进行荧光检测。
[0181] ⑶结果分析
[0182]
[0183] 根据以上比值判断，样本1所有六组比值均小于2. 0,判断该乳腺癌患者为HER2阴 性；样本2中有四组比值大于2. 0,判断该乳腺癌患为HER2阳性。
[0184] 实施例2ddPCR技术检测赫赛汀耐药性
[0185] 1-30号乳腺癌患者样本，分别用传统IHC和FISH技术和如实施例1中所述的方 法，测定得到各个样本的Hl/Cl、Hl/El、H1/E2、H2/C1、H2/E1、H2/E2值。结果如下表所示：
[0186]
[0188] 其中，17和18号患者，在肿瘤确诊后进行了循环肿瘤细胞CTC检测，分别检出3个 和5个CTC，其中分别有2个和3个CTC为Her2阳性。在医生的建议下，患者于手术后开始 使用赫赛汀，一年后无复发现象，肿瘤控制较好。
[0189] 另外13、14、15、16、19和20号患者因无法根据IHC和FISH技术进行Her2阳性判 断，医生未对其使用赫赛汀。用本发明的方法，鉴定19号以及20号患者为Her2阳性，13、 14、 15、16号患者为Her2阴性。通过本发明方法鉴定为Her2阳性的患者（19和20号），1 年内肿瘤均出现不同程度转移或复发；而用本发明的方法鉴定为Her2阴性的患者（13、14、 15、 16)，仅1例患者在1年半后出现转移（14号）。
[0190] 21和22号的患者FISH检测为Her2阳性，IHC检测为临界值，本发明方法检测为 阴性，医生推荐其使用了赫赛汀。两名患者分别在第8个月和第10个月复发，表明其未从 赫赛汀使用中获益，这与使用本发明方法的鉴定结果一致（阴性）。
[0191] 此外，可以看出，若仅用CEP17作为内参，则仅看H1/C1和H2/C1的结果，即18、20 和25号患者检出结果与实际结果并不一致。当仅用CEP17作为内参时，显示这三位患者为 Her2阴性，而采用CEP 17和EFTUD2同时作为内参时，得出这三位患者均为阳性，与用药后的 实际结果一致，说明EFTUD2内参位点的引入有助于提高乳腺癌Her2阳性的判断准确度。
[0192] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种HER2拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：用于检测HER2 基因的两对引物，和用于检测选自下组的内参基因的一对或多对引物：CEP 17、EFTUD2，或其 组合。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括用于检测CEP17基因的 一对引物。3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括用于检测EFTUD2基因 的2对引物。4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： (a) 第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含HER2基因的特异引物对； (b) 第二容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含HER2基因的特异引物对； (c) 第三容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含CEP17基因的特异引物对； (d) 第四容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含EFTUD2基因的特异引物对； (e) 第五容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含EFTUD2基因的特异引物对； (f) 使用说明书（如插页），其中，所述说明书记载了使用方法。5. -种如权利要求1-4中任一所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于制备：(a)用于 检测或判断肿瘤患者是否对赫赛汀敏感的试剂盒；(b)用于判断肿瘤患者是否适合使用或 继续使用赫赛汀进行治疗的试剂盒；（c)用于检测或判断肿瘤患者是否对赫赛汀敏感。6. -种样本中HER2突变阳性检测方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 提供一检测样本，所述的检测样本是肿瘤组织样本； (2) 对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物； (3) 以步骤（2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含 HER2基因和内参基因的扩增产物；和 (4) 对所述扩增产物进行分析，从而得出HER2基因和内参基因的突变形式和/或比 例； 其中，所述的内参基因是CEP 17和EFTUD2。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，在ddPCR中，反应体系中还含有用于检测 HER2基因和内参基因的探针。8. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的样本来自于选自下组的检测对 象：乳腺癌患者。9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤（4)包括：分析所述HER-2引物 对H1、H2,内参基因 CEP17引物对C1、内参基因 EFTUD2引物对E1和E2扩增产物的拷贝数， 并用HER-2基因拷贝数去除以内参基因拷贝数，得到六组比值，即HI/C1，HI/E1，HI/E2，H2/ C1，H2/E1，H2/E2,若六个比值均小于等于2. 0,则判定为Her2阴性，若六个比值中有1个大 于2. 0,则判定为Her2阳性。10. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：对来自于同一检测对 象的外周血浆进行ddPCR检测，得到其mRNA表达和DNA拷贝数变异。
【文档编号】C12Q1/68GK105986028SQ201510128819
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年3月23日
【发明人】张桢珍, 许骋, 易静, 丁飞飞, 徐本梅, 吴云鸣, 楼敬伟, 王剑鹏, 崔祥滨, 王臻, 王岭, 盛湲
【申请人】上海宝藤生物医药科技股份有限公司, 上海张江转化医学研发中心有限公司, 上海宝藤医学检验所有限公司