微球富集增强技术检测循环肿瘤细胞抗原的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了微球富集增强技术检测循环肿瘤细胞抗原的方法及试剂盒。所述方法步骤如下：1）取乳胶微球加入MES缓冲溶液HER2兔单抗抗体，BSA，HRP，EDC混合吹打均匀；在45℃振荡反应1h；离心并用洗涤液洗涤，去上清；用封闭液定容，45℃振荡封闭30min，离心洗涤一次；最后定容储存备用；2）取细胞悬液于微孔反应条板中，用PBS定容，加入生物素标记EpCAM抗体和抗体标记的乳胶微球，室温振荡反应1h；加入链霉亲和素磁珠，室温下振荡反应1h；磁分离，洗涤并且去除上清；然后进行显色反应。一种试剂盒，包括HRP和HER2抗体标记的80nm乳胶微球。另一种试剂盒，包括80nm乳胶微球、用于标记乳胶微球的HER2兔单抗抗体和HRP。本发明灵敏度高，准确性好，具有成本优势，便于普及应用。
【专利说明】
微球富集増强技术检测循环肿瘤细胞抗原的方法及试剂盒
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种免疫检测循环肿瘤细胞抗原的方法。
【背景技术】
[0002] 在全球范围内，乳腺癌是女性群体中最常见的恶性肿瘤，在所有病例中，约有so-so% 为"最凶险的乳腺癌"一一HER2阳性乳腺癌。相对于其他类型的乳腺癌，HER2阳性乳腺 癌的疾病进展速度更快，恶性程度更高，更容易复发和转移，预后也较差。
[0003] 中国的乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，尤其在京、津、沪等大城市，乳腺癌已位 居女性恶性肿瘤发病率之首。根据乳腺癌的生物学特性，可以把其分成4~5个分子亚群，不 同的亚群有不同的预后和治疗策略。现代医学已经进入了乳腺癌分类治疗的时代，搞清患 者的分子类型是正确治疗的前提，在所有乳腺癌患者中，属于ffiR2基因过表达者占20%-30%，和其他亚群乳腺癌相比，该类型乳腺癌患者更容易出现复发和转移。如果只接受常规 综合治疗，J1ER2阳性乳腺癌患者的生存时间仅为HER2阴性患者的一半;相反，如果能及早确 定HER2状态，及早采用针对性治疗，与普通乳腺癌患者相比，HER2阳性患者的生存机会就会 接近HER2阴性患者。
[0004]自从1987年Slamon等发现了HER2在人类乳腺癌发病机制中的作用，而经典的抗 HER2靶向治疗药物曲妥珠单抗自1998年经美国FDA批准用于临床以来也已应用了10余年， 认为乳腺癌HER2状态是乳腺癌患者重要的预后因子和靶向药物疗效的预测因子。大量研究 数据和临床实践已使大家在抗J1ER2治疗作用机制和临床疗效等方面达成一定的共识。而目 前临床上检测HER2状态都是基于患者原发灶或者转移灶组织的检测，而这些检测往往会受 到肿瘤组织(取材、固定和保存等操作不当）、检测方法、肿瘤异质性或变异等影响，造成患 者的HER2状态无法确定，特别是一些复发转移性患者，以往肿瘤组织保存时间较长或者转 移灶无法活检获取组织等情况，更无法在治疗过程中对患者进行动态的监测。针对HER-2阳 性乳腺癌患者的靶向治疗，目前的临床指南是:①HER2阳性乳腺癌术后辅助治疗建议使用 赫赛汀靶向治疗一年为标准治疗;②进展期HER-2阳性乳腺癌建议赫赛汀使用至少一年，并 推荐使用直至进展，甚至，在靶向维持治疗进展后仍可继续赫赛汀靶向治疗基础上更换新 的化疗。
[0005]从HER-2阳性乳腺癌患者的生物学特征和靶向治疗的疗效，只有尽早、准确进行 HER2状态的检测，才能对患者进行复发风险度准确评估和采取正确的针对性治疗(赫赛汀 等靶向药物）。传统对石蜡包埋组织采用常规免疫组化法和FISH(原位荧光杂交)方法对组 织标本制作和保存有较高的要求，因此，一旦这些手术或者活检组织标本不能满足检测要 求，患者的HER-2状态就无法确定，肿瘤分子分型和分类治疗就无法进行，临床上屡见这类 患者，如标本保存时间太长、术前化疗前标本留取太少、以往的检测方法不标准、反复检测 HER-2属于临界状态、患者复发转移与原肿瘤生物学行为不符但转移灶无法重新活检等，临 床上无法鉴定患者真正的HER-2状态;HER-2靶向药物赫赛汀本身相当昂贵，还有潜在的心 脏毒性，这使得临床医生在患者使用靶向治疗的决策上左右为难、难以取舍。此外，除了客 观有效率的评价之外，HER-2阳性乳腺癌患者接受靶向治疗期间处于稳定或者完全缓解情 况下，目前临床上还无法对其进行进一步的动态疗效检测，循环肿瘤标记物和循环肿瘤细 胞(CTC)检测只能在一定程度上发挥作用，但并非真正反映体内HER-2阳性乳腺癌细胞的动 态变化和疗效。
[0006] 循环肿瘤细胞(CTCs)检测是目前公认的能够很好监测肿瘤患者体内肿瘤负荷的 理想方法，在癌症治疗中，医生常常希望将循环肿瘤细胞水平作为监控和调整治疗和预后 的诊断依据，但传统检测方法往往无法准确地确定患者体内的CTCs水平，Ce 11 Search血液 中循环肿瘤细胞系统是Veridex公司专有的一项技术，已通过美国FDA准入应用于预测有转 移性的乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌的无进展存活率和总存活率。该检验方法可随时进行， 便于对此类癌症患者进行连续监测。在欧洲，CellSearch也被认定是一个有效的诊断检验 工具。我国已经完成了该项技术的临床研究，正在向国家H)A申请批件，研究结果与国外同 类研究基本一致。CellSearch检测的工作原理是，采用了一种可同铁微粒相结合的抗体(称 为铁磁流体），这种抗体/铁磁流体同CTCs有极强的特异性结合能力。结合后再应用强力磁 体将这些CTCs从血液样本中提取出，达到细胞富集的作用，在进行生物或化学染色后可以 在CellSearch检测仪上准确识别CTCs并计数。目前认为晚期乳腺癌患者检测血液中循环肿 瘤细胞系统CTC临界值是多5CTCs，研究已经证明，乳腺癌患者治疗前多5CTCs者PFS(无进展 生存时间)较短，在治疗后如果患者的循环肿瘤细胞数降低到5个以下，则其PFS将得到明显 延长。因此，CTCs检测对于乳腺癌患者预后和疗效评估十分重要，能够改进晚期乳腺癌的治 疗策略。目前市场上CellSearch检测仪的价格大约400万元，不计检测试剂，一般医疗机构 无法引进该项检测技术，一旦引进，其检测的价格亦不菲。因此，普通患者无法承受其作为 常规检测，更不能作为治疗期间的动态监测。
[0007] 近年来，生物分析技术与纳米技术的深入结合是国际生物医学分析技术领域的前 沿和热点问题。与传统材料相比，纳米级的颗粒存在比表面积大和小尺寸效应等特点。而磁 性高分子微球的研究始于20世纪70年代，是利用纳米技术制备出的一种具有磁性特性的微 球。此类微球一方面，它具有有机聚合物微球的众多特性，如可通过共聚、表面改性等途径， 赋予其表面多种反应性官能团（如羟基、氨基、羧基等），可通过吸附或共价键合的方式与抗 体、DNA、RNA等生物活性物质结合;另一方面，由于它具有磁性可以很方便地在外加磁场作 用下从介质中分离出来。与传统的分离技术相比，该方法将分离与富集结合于一体，其较大 的比表面积大大提高了分离过程中反应物之间相互作用的动力学速度，具有高效、快速、非 玷污的优点。因此，磁性高分子微球被广泛地应用作分离材料和载体，如在临床诊断、靶向 药物、细胞分离、细胞标记等领域有着广阔的应用前景。
【发明内容】
[0008] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了微球富集增强技术检测循环肿瘤细胞抗 原的方法及试剂盒。
[0009] -种微球富集增强技术检测循环肿瘤细胞抗原的方法，步骤如下：
[0010] 1 )HRP和HER2抗体标记乳胶微球的合成：
[0011] 取l〇〇ul固含量10%w/v 80nm乳胶微球加入MES缓冲溶液吹打均匀，再加入 0 ? 614ug HER2兔单抗抗体，90ugBSA，9ugHRP，5mg EDC并吹打均匀，总体系为lmL;在45°C振 荡反应lh;离心并用洗涤液洗涤，去上清；用封闭液定容至原体积lmL，45°C振荡封闭30min， 离心并用封闭液洗涤一次;最后用含有0.5%蔗糖的封闭液定容至lmL;4°C储存备用；
[0012] 2)外周血中循环肿瘤细胞抗原的检测：
[0013] 取10-20uL细胞悬液于微孔反应条板中，用pH为2的PBS定容至200uL，加入 luL0.0 4mg/mL的生物素标记EpCAM抗体和50uL步骤1)中抗体标记的乳胶微球，室温振荡反 应lh;加入2uL 1 %链霉亲和素磁珠，室温下振荡反应lh;磁分离，洗涤并且去除上清；加入 100微升TMB及底物混合液和50微升1 %过氧化尿素溶液，室温条件下避光15min，避光结束 后加入50微升硫酸终止液;磁分离，取150微升上清并在酶标仪中测量0D450。
[0014] 一种采用所述方法的试剂盒，包括HRP和HER2抗体标记的80nm乳胶微球。
[0015] 一种采用所述方法的试剂盒，包括80nm乳胶微球、用于标记乳胶微球的HER2兔单 抗抗体和HRP。
【附图说明】
[0016]图1是已知低浓度样本的标准曲线；
[0017] 图2是已知高浓度样本的标准曲线。
【具体实施方式】
[0018] 由于纳米乳胶微球具有较大的比表面积，可以成为蛋白质核酸等物质的优良载 体。本发明采用磁性微球分离与富集ffiR-2阳性乳腺癌细胞，并用小尺度的纳米乳胶微球作 为固相载体同时偶联抗体和酶分子，替代常规ELISA中的酶标抗体，操作方法如常规ELISA 操作，使用酶标仪进行读数。相比传统的复合反应过程纳米载体能够引入更多酶分子(如辣 根过氧化物酶HRP)，带来更显著的检测信号，达到增强的作用。
[0019] -、材料和试剂
[0020]表1为药品规格，如果没有特别指出，为常规试剂。
[0021]表1
[0023] PBS缓冲液：8gNaCl，0 ? 2gKCl，1 ? 42gNa2HP〇4，0 ? 27gKH2P〇4溶于 1L去离子水中，调节 PH；
[0024] MES缓冲液:0? 1562gMES溶于40mL去离子水中，调节pH;
[0025]洗涤缓冲液:0.15g甘氨酸溶于lOOmLMES缓冲液中；
[0026] 封闭液:0? 15g甘氨酸，lgBSA溶于lOOmLMES缓冲液中；
[0027] R2:将0.5% (质量百分比）蔗糖溶于封闭液中；
[0028] TMB 溶液：3mgTMB 溶于 lmLDMSO 中；
[0029] 底物稀释液:2.52g柠檬酸，3.26gNa2HP〇4,溶于120mL去离子水中；调节pH至5.5;
[0030] 1%过氧化尿素溶液：10mg过氧化尿素溶于lmL去离子水中；
[0031] 终止液:2mo 1 /L硫酸。
[0032] 二、实验步骤
[0033] 1 )HRP和HER2抗体标记乳胶微球的合成：
[0034] 取100uL固含量10%(w/v)乳胶微球加入适量MES缓冲溶液吹打均匀，再加入 0.614ugHER2兔单克隆抗体，90ugBSA，9ugHRP，5mgEDC并吹打均匀；在金属浴中45°C振荡反 应lh;离心并用洗涤液洗涤3次，去上清；用封闭液定容至lmL，在金属浴中45°C振荡封闭 30min离心并用封闭液洗涤一次;最后用R2定容至lmL;4°C储存备用。
[0035] 2)外周血中循环肿瘤细胞抗原的检测：
[0036] 取10-20uL细胞悬液于微孔反应条板中，用pH为2的roS定容至200uL，加入0.04ug 生物素标记EpCAM鼠单抗(0.04mg/mL)和50uLHRP和HER2抗体标记的乳胶微球，室温条件下 振荡反应lh;加入2uLl % (w/v固含量)链霉亲和素磁珠，室温下振荡反应lh;磁分离，洗涤3 次并且去除上清;取100uL 3mg/mL的TMB溶液和1.9ml底物稀释液配成TMB及底物混合液，并 向上述沉淀中加入100uL TMB混合液和50uL 1 %过氧化尿素溶液，室温条件下避光15min， 避光结束后加入50uL硫酸终止液;磁分离，取150uL上清于干净的96孔板中，并在酶标仪中 测量0D450。
[0037]三、结果
[0038] 1、线性范围
[0039] 线性范围评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重 要申报资料之一。
[0040] 当需要测定溶液的浓度时，不论溶液的浓度是试剂本身的浓度，还是试剂和样本 (如血清、质控品、标准品、校准品）反应的浓度，通常采用浓度和吸光度之间建立标准曲线 的方法测定，若证明这种标准曲线是否存在线性关系，做法是根据WS/T124《临床化学体外 诊断试剂盒质量检验总则》关于线性范围的规定，把选取的溶液浓度范围取6点，包括浓度 的下限（或〇)、中间值及上限，每点重复测定3次吸光度。根据公式计算出直线方程y = a+bx 和回归系数。
[0041] 当浓度和吸光度之间有了直线方程y = a+bx的关系，就可以快捷的通过溶液的吸 光度值计算出对应的浓度。利用线性范围公式的计算，推证出完善的校准曲线，从而为检测 试剂的灵敏度、准确度、精密度打好基础。
[0042] 1)试剂线性实验1
[0043]按上述检测试剂盒的使用方法，取5种已知低浓度的样本，每个样本测定3次，取平 均值，结果如图1所示。
[0044] 2)试剂线性实验2
[0045] 按上述检测试剂盒的使用方法，取5种已知高浓度的样本，每个样本测定3次，取平 均值，结果如图2所示。
[0046] 2、精密度
[0047] 精密度是考察试剂盒对同一样本重复测定时能否得到相同实验结果的能力的指 标，通常用重复多次样本测量结果的变异系数(CV%)表示，精密度评价是质量控制的重要 内容。精密度评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重要申 报资料之一。
[0048] 批内精密度是众多种类精密度中最基本的一个，它是在严格的相似条件下，所得 到的最佳的精密度。
[0049] 按上述检测试剂盒的使用方法，在检测范围内取两个不同细胞数的样本进行测 定，每个样本测定7次，将7次检测结果计算平均值，标准差和变异系数，结果如下表2所示。
[0050] 表 2
[0052] 3、准确度
[0053]很多临床实验室内部，通常会有两个以上的检测系统，多个检测系统之间应该定 期进行比对。对于开放检测系统，也应该对系统进行验证，其中最重要的一项便是准确度的 评价，准确度评价可以通过方法学比对来实现，利用两种方法的比对对比配套系统的准确 度进行评估是评估准确度的方法之一。准确度评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依 据，也是产品注册所需的重要申报资料之一。
[0054] 按上述检测试剂盒的使用方法，取具有溯源性的标准品，用试剂进行检测，检测7 次，计算平均值与靶值进行对照，结果如下表3所示。
[0055] 表 3
[0057] 4、灵敏度
[0058] 按上述检测试剂盒的使用方法，测定7种不同细胞浓度的样品，每个样品测7次，通 过计算变异系数(CV%)，定义开始大于20%的点即为该试剂盒的灵敏度，本发明的检测试 剂盒的灵敏度为3个/7.5mL，结果如下表4所示。
[0059] 表 4
[0061 ] 5、稳定性
[0062] 稳定性试验
[0063] 在2~8°C贮存条件下，分别在0月，4月，8月，12月和14月对同一浓度的细胞进行测 定，每个样本测5次，取均值。结果表明，4月，8月，12月，14月与0月相比，测得的差异很小，说 明本发明的检测试剂盒在2~8°C贮存条件下可稳定一年，结果如下表5所示。
[0064] 表 5
[0066]试剂开封后，在30天内，30次测定同一浓度的抗体样本的吸光度均值、最大值、最 小值、标准差和吸光度变异系数，可见本试剂盒试剂在开封后，可稳定一个月以上，结果如 表6所示。
[0067]表 6
【主权项】
1. 一种微球富集增强技术检测循环肿瘤细胞抗原的方法，其特征在于，步骤如下： I )HRP和HER2抗体标记乳胶微球的合成： 取IOOul固含量10% w/v 80nm乳胶微球加入MES缓冲溶液吹打均匀，再加入0.614ug HER2兔单抗抗体，90ug BSA，9ug HRP，5mg EDC并吹打均匀，总体系为ImL;在45°C振荡反应 Ih;离心并用洗涤液洗涤，去上清；用封闭液定容至原体积ImL，45 °C振荡封闭30min，离心 并用封闭液洗涤一次;最后用含有0.5%蔗糖的封闭液定容至ImL; 4°C储存备用； 2)外周血中循环肿瘤细胞抗原的检测： 取10-20uL细胞悬液于微孔反应条板中，用pH为2的PBS定容至200uL，加 IuL 0 · 04mg/mL 的生物素标记EpCAM抗体和50uL步骤1)中抗体标记的乳胶微球，室温振荡反应Ih;加入2 uL 1%链霉亲和素磁珠，室温下振荡反应Ih;磁分离，洗涤并且去除上清;加入100微升TMB及底 物混合液和50微升1%过氧化尿素溶液，室温条件下避光15min，避光结束后加入50微升硫酸 终止液;磁分离，取150微升上清并在酶标仪中测量0D450。2. -种采用如权利要求1所述方法的试剂盒，其特征在于，包括HRP和HER2抗体标记的 80nm乳胶微球。3. -种采用如权利要求1所述方法的试剂盒，其特征在于，包括SOnm乳胶微球、用于标 记乳胶微球的HER2兔单抗抗体和HRP。
【文档编号】G01N33/577GK105891492SQ201610327849
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】沈晓亮, 王晓稼, 赵甜甜
【申请人】浙江天科高新技术发展有限公司, 浙江省肿瘤医院