一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条及其制备方法，主要包括经过处理的样本垫、包被有检测磁珠的第一结合垫、包被有信号磁珠的第二结合垫、硝酸纤维素膜、底板和吸水纸，硝酸纤维素膜上固定有IgG抗体即质控线和CEA包被抗体即检测线。制备方法包括将吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫、样本垫依次叠加组合。本发明综合了磁珠与放大系统的特点，达到了灵敏特异、定量检测的目的，成本低廉，同时支持小样本与大样本检测，操作简单，检验方便快速，适合大规模的推广生产。
【专利说明】
一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于医学检测领域，特别涉及一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002]癌胚抗原(Carcino-embryonic antigen，CEA)是细胞表面的一种糖蛋白，通常在发育中的胚胎组织内能够检测到较高的CEA含量。正常成人血清内CEA的含量很低，但多种癌症患者体内的CEA水平存在异常升高。CEA与肿瘤的扩散和转移息息相关，临床上已将其作为一种较广谱的糖蛋白肿瘤标志物，广泛应用于胃肠癌、肺癌、肠癌以及胰腺癌等的检测中，用来进行良性肿瘤与恶性肿瘤的区分以及肿瘤分期情况的判断等。一些非肿瘤疾病，如炎症、息肉患者血清中的CEA含量也会有一定程度的增多，但恶性肿瘤将导致CEA水平远远高于正常值。目前临床上判定CEA的正常临界值为5ng/ml，将其作为判断癌症的发生和预后情况的重要辅助指标。
[0003]临床上用于检测血清中CE A含量的方法主要有电化学发光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)、放身才免疫测定法(rad1immunoassay，RIA)以及酶联免疫分析法(enzyme-1 inked immunosorbent assay，ELISA)等等。ECLIA被广泛应用于临床检测，此种方法的灵敏度高，特异性好，分析结果稳定，对环境的污染小，是一种新发展的免疫检测方法。但ECLIA技术操作复杂，依赖于精密仪器平台，成本和患者的检测费用较高。RIA方法的应用范围较广，操作简便，但对环境会造成放射性污染，试剂的储存时间短。ELISA方法的成本，应用领域广泛，但其结果的稳定性有待提高，且ELISA—般用于大批量样本检测，单人或少量样本检测比较困难，操作过程繁琐。侧流免疫层析技术(lateral-flow immunoassay，LFIA)作为一种方便、快速的免疫诊断技术，得到了广泛关注和迅速发展。LFIA技术基于免疫标记的纳米颗粒，如纳米金、量子点等，但针对CEA的免疫层析检验的灵敏度大多在ng/ml级别，而且多局限于定性或半定量检测。
[0004]磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles，MNPs)被越来越多地用作纳米生物标记材料来替代传统的标记物。MNPs具有稳定的物理性质，在生物标记的过程中不受环境的影响，不易与其它物质反应，检验的重复性好。更重要的是，MNPs能够产生稳定的磁信号，经过磁信号检测仪的接收，将其转化成相关的生物信号，实现定量检测。基于磁信号的检测不局限于免疫试纸条表面的纳米磁珠粒子，深层的不被肉眼可见的纳米磁珠也能够产生磁信号，因此纳米磁珠用于免疫层析检验能够达到更高的灵敏度。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条及其制备方法，该试纸条综合了磁珠与放大系统的特点，达到了灵敏特异、定量检测的目的，成本低廉，同时支持小样本与大样本检测，操作简单，检验方便快速，适合大规模的推广生产。
[0006]本发明的一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条，包括底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫和样本垫;所述第一结合垫包被有检测磁珠，所述第二结合垫包被有信号磁珠，所述硝酸纤维素膜上喷有羊抗鼠(IgG)抗体和CEA包被抗体。
[0007]本发明的一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条的制备方法，包括:
[0008](I)将IgG抗体和CEA包被抗体稀释，随后喷淋在硝酸纤维素膜上形成C线(质控线)和T线(检测线)，烘干；
[0009](2)取玻璃纤维素膜浸泡于样本垫处理液中，取出烘干，得到样本垫;取另一玻璃纤维素膜浸泡于结合垫处理液中，取出烘干，得到结合垫；
[0010](3)取磁珠原液，用MES缓冲液清洗、磁分离、重悬，加入EDC、CEA抗体和生物素寡核苷酸探针进行标记，再加入牛血清白蛋白BSA继续标记，磁分离、清洗，用结合垫处理液重悬，将所得溶液铺在上述结合垫上，烘干，得到第一结合垫；
[0011 ] (4)取磁珠原液，用MES缓冲液清洗、磁分离、重悬，加入EDC和链霉亲和素SA进行标记，磁分离、清洗，用结合垫处理液重悬，将所得溶液铺在另一结合垫上，烘干，得到第二结合垫；
[0012](5)将吸水垫、步骤(I)得到的硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、步骤(2)得到的样本垫依次交错叠加，切割成免疫层析试纸条。
[0013]所述步骤(I)中的IgG抗体用灭菌氯化钠溶液稀释;CEA包被抗体用PBS缓冲液稀释。
[0014]所述步骤(2)中的样本垫处理液的组成为:0.003M硼酸，0.004M硼酸钠，0.5 % w/v氯化钠，0.5 %w/V牛血清白蛋白BSA和2 % v/V Tween-20。
[0015]所述步骤(2)和(4)中的结合垫处理液的组成为:0.003M硼酸，0.004M硼酸钠，10 %w/V鹿糖，2 %w/V海藻糖，0.05 % v/v Tween-20。
[0016]所述步骤(3)中的标记温度为25°C，标记时间为30min?1.5h。
[0017]所述步骤(4)中的标记温度为25°C，标记时间为2h。
[0018]所述步骤(5)中交错I?2mm叠加。
[0019]所述步骤(5)中的免疫层析试纸条使用方法为:将试纸条放置在Squid超导量子干涉器件中，匀速稳定移动试纸条，磁性粒子在装置中的运动引起磁场变化，产生随时间变化的磁场强度值pT/V，经过相关系数的换算，得到磁场强度值pT。
[0020]本发明在传统的免疫层析检验技术的基础上，利用生物素-链霉亲和素系统(b1tin-streptavidin system，BSS)稳定地连接检测纳米磁珠和信号纳米磁珠，实现检测灵敏度的放大。结合磁珠可以产生稳定磁信号的优势，实现了针对CEA的高灵敏度定量免疫层析检验。具体的，本发明是以生物素-链霉亲和素系统为放大原理，将标记有CEA抗体的200nm免疫磁珠同时标记生物素-寡核苷酸探针，与标记有链霉亲和素(SA)的200nm信号磁珠连接在一起。
[0021]有益效果
[0022](I)本发明通过生物素-链霉亲和素系统，对检测信号的灵敏度进行了提高，使改进后的试纸条检测CEA的灵敏度提高了 20倍。
[0023](2)本发明利用磁珠稳定的磁性能，通过磁信号检测仪检测硝酸纤维素膜上条带的磁信号，实现了定量检测。
[0024](3)本发明综合了磁珠与放大系统的特点，达到了灵敏特异、定量检测的目的，制备过程成本低廉，同时支持小样本与大样本检测，操作简单，检验方便快速，适合大规模的推广生产。
【附图说明】
[0025]图1为本发明免疫层析试纸条各部分组成示意图；
[0026]图2为本发明免疫层析试纸条中第一结合垫上预包被检测磁珠和第二结合垫上预包被信号磁珠不意图；
[0027]图3为本发明检测过程中发生的具体反应的示意图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0029]实施例1
[0030]如图1所示，本实施例提供了一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条，包括底板
1、吸水垫2、硝酸纤维素膜3、第一结合垫4、第二结合垫5和样本垫6。第一结合垫4包被有检测磁珠，第二结合垫5包被有信号磁珠。硝酸纤维素膜3上喷有IgG抗体(C线)7和CEA包被抗体(T线)8。
[0031 ]将血清样品逐滴滴加到样本垫上，液体依次流经第二结合垫、第一结合垫、T线和C线。当样品中含有CEA抗原时，抗原先与第一结合垫上的检测磁珠结合，液体由于层析作用向前流动到达T线时，包被抗体亦能识别CEA抗原，形成“双抗夹心”结构，从而将磁珠截留在T线上，T线显色。随后第二结合垫上的信号磁珠通过BSS系统与检测磁珠结合，从而增强信号。未被T线截留的检测磁珠继续流动到达C线，被具有非特异识别能力的IgG截留，C线显色(如图3)。反之，若样本中不含抗原，T线将不会显色，C线仍然显色。因此，C线显色是保证试纸条有效的标志。显色后的试纸条通过磁信号检测装置读取信号，完成定量检测。
[0032]实施例2
[0033]I)包被硝酸纤维素膜:使用浓度为0.135M的灭菌氯化钠溶液，将IgG抗体稀释到lmg/ml浓度;使用浓度为10mM、pH= 7.4的PBS缓冲液，将CEA包被抗体的浓度稀释到2mg/ml。首先将硝酸纤维素膜组装于底板上的合适位置，再使用定量喷液装置分别将两种抗体喷在硝酸纤维素膜的不同位置上，形成C线和T线，将喷有抗体的硝酸纤维素膜置于25°C下烘干4h，放置在干燥环境下保存。
[0034]2)样本垫的预处理:将玻璃纤维素膜浸泡在样本垫处理液中，约30min后取出，37°C烘干4小时，放置在干燥环境下保存。所述样本垫处理液的配方为:含0.003M硼酸，0.004M硼酸钠，0.5% (w/v)氯化钠，0.5% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)和2% (v/v)Tween_20的水溶液。
[0035]3)结合垫的预处理:将玻璃纤维素膜浸泡在结合垫处理液中，约30min后取出，37°C烘干4小时，放置在干燥环境下保存。所述结合垫处理液的配方为:含0.003M硼酸，0.004M硼酸钠，10%(￥八)鹿糖，2%(￥八)海藻糖，0.05%(>八；^6611-20的水溶液。
[0036]4)第一结合垫上检测磁珠的制作:取200nm磁珠原液，用0.0lM MES缓冲液清洗两遍，磁分离后吸弃上清液，用0.0lM MES溶液重悬到0.5mg/ml浓度，加入0.25mg/ml EDC、15μg/ml CEA抗体、50nM Mfc-b1tin寡核苷酸探针，吹打混勾后放入恒温振荡摇床，600rpm，25°C标记30min后，加入0.5yg/ml BSA，混匀后继续在恒温振荡摇床上标记1.5h，磁分离后吸弃上清液，用灭菌水清洗两遍，用结合垫处理液重悬到4.3mg/ml，将溶液均匀铺在结合垫上，37°C 烘干 20min。
[0037]5)第二结合垫上信号磁珠的制作:取200nm磁珠原液，用0.0lM MES缓冲液清洗两遍，磁分离后吸弃上清液，用0.0lM MES溶液重悬到0.5mg/ml浓度，加入0.25mg/ml EDC、15μg/ml SA，吹打混匀后放入恒温振荡摇床，600rpm，25°C标记2h，磁分离后吸弃上清液，用灭菌水清洗两遍，用结合垫处理液重悬到3.3 m g / m I，将溶液均匀铺在结合垫上，3 7 °C烘干20mino
[0038]6)试纸条的组装:将吸水垫、硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、样本垫依次交错约I?2mm叠加，切割成宽约3mm左右的试纸条待用。
[0039]7)磁信号的定量检测:将试纸条放置在Squid超导量子干涉器件中，匀速稳定移动试纸条，磁性粒子在装置中的运动引起磁场变化，产生随时间变化的磁场强度值pT/V，经过相关系数的换算，得到磁场强度值PT。
[0040]8)试纸条灵敏度实验
[0041 ]使用CEA抗原进行6次重复实验，其灵敏度约为0.25ng/ml。
[0042]9)试纸条特异性实验
[0043]滴加其它不同蛋白标志物:NSE，CYFRA21-1，C-反应蛋白，肌红蛋白，肌钙蛋白，Pro-GRP，未见有非特异性反应。
【主权项】
1.一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条，包括底板(I)、吸水垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、第一结合垫(4)、第二结合垫(5)和样本垫(6);其特征在于:所述第一结合垫(4)包被有检测磁珠，所述第二结合垫(5)包被有信号磁珠，所述硝酸纤维素膜(3)上喷有IgG抗体(7)和CEA包被抗体(8)。2.—种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条的制备方法，包括: (1)将IgG抗体和CEA包被抗体稀释，随后喷淋在硝酸纤维素膜上形成C线和T线，烘干； (2)取玻璃纤维素膜浸泡于样本垫处理液中，取出烘干，得到样本垫；取另一玻璃纤维素膜浸泡于结合垫处理液中，取出烘干，得到结合垫； (3)取磁珠原液，用MES缓冲液清洗、磁分离、重悬，加入EDC、CEA抗体和生物素寡核苷酸探针进行标记，再加入牛血清白蛋白BSA继续标记，磁分离、清洗，用结合垫处理液重悬，将所得溶液铺在上述结合垫上，烘干，得到第一结合垫； (4)取磁珠原液，用MES缓冲液清洗、磁分离、重悬，加入EDC和链霉亲和素SA进行标记，磁分离、清洗，用结合垫处理液重悬，将所得溶液铺在另一结合垫上，烘干，得到第二结合垫； (5)将吸水垫、步骤(I)得到的硝酸纤维素膜、第一结合垫、第二结合垫、步骤(2)得到的样本垫依次交错叠加，切割成免疫层析试纸条。3.根据权利要求1所述的一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中的IgG抗体用灭菌氯化钠溶液稀释;CEA包被抗体用PBS缓冲液稀释。4.根据权利要求1所述的一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的样本垫处理液的组成为:0.003M硼酸，0.004M硼酸钠，0.5%w/v氯化钠，0.5 %w/V牛血清白蛋白BSA和2 % v/V Tween-20。5.根据权利要求1所述的一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)和(4)中的结合垫处理液的组成为:0.003M硼酸，0.004M硼酸钠，10 %w/V鹿糖，2 %w/V海藻糖，0.05 % v/v Tween-20。6.根据权利要求1所述的一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中的标记温度为25 °C，标记时间为30min?1.5h。7.根据权利要求1所述的一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中的标记温度为25 °C，标记时间为2h。8.根据权利要求1所述的一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:所述步骤(5)中交错I?2mm叠加。9.根据权利要求1所述的一种定量检测癌胚抗原的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于:所述步骤(5)中的免疫层析试纸条使用方法为:将试纸条放置在Squid超导量子干涉器件中，匀速稳定移动试纸条，磁性粒子在装置中的运动引起磁场变化，产生随时间变化的磁场强度值pT/V，经过相关系数的换算，得到磁场强度值pT。
【文档编号】G01N33/558GK105891485SQ201610309155
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】毛红菊, 刘芳铭, 孔祥燕, 张宏莲, 金庆辉, 赵建龙
【申请人】中国科学院上海微系统与信息技术研究所