组合型胺类代谢标志物的应用及试剂盒与检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新的胺类组合标志物在诊断早期肝性脑病中的应用。属于分析化 学及临床医学及医学领域。
【背景技术】
[0002] 肝性脑病（Hepatic encephalopathy, HE)是由急、慢性肝功能衰竭或各种门-体 分流引起的、以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失调的综合征。该综合症常见于终 末期肝硬化，根据意识障碍程度、神经系统表现和脑电图改变，将HE自轻微的精神改变到 深昏迷分为0-4期（west Haven分期）。早期肝性脑病（如0期，即轻微型肝性脑病MHE) 是肝性脑病发展过程中的特殊阶段，具有发病率高，隐蔽性强的特点，在我国发病率为 24. 7% -85%，在肝硬化患者中发病率为51. 3%，因其难以被发现和治疗，导致病情恶化， 一旦进展为临床型肝性脑病致死率可高达50%，因此，肝性脑病早期诊断尤为重要。目前， 诊断方法有智能测试，神经电生理和神经电心理测试诊断和核磁共振波谱成像（MRS)三 类，前两者测试虽简单，但易受年龄、文化程度影响；而基于MRS的诊断虽然更精密、客观、 敏感，但其检测成本较高。目前，肝性脑病发病机制仍不清楚，同时缺乏早期诊断的金标准， 因此，开发新的高灵敏度和特异性的诊断方法势在必行。
[0003] 已有研究表明肝性脑病涉及到许多胺类（特别是氨基酸类）的代谢，如细 胞增殖方面：多胺类物质在细胞生长和增殖以及蛋白质和核酸的合成中有着重要的 作用[参考文献 I :J.Janne，L.Alhonen，T.A.Keinanen，M. Pietila, A. Uimari, E. Pirinen, Μ· T. Hyvonen, A. Jarvinen, J. Cell. Mol. Med. 9 (2005)865 - 882·];稳态调节方 面：支链氨基酸在加速氨的解毒，调整氨基酸平衡，减少脑中芳香族氨基酸的流入，促 进蛋白质合成，谷氨酰胺的的生成，抑制蛋白质水解中有着重要的作用[参考文献2 : Holecek M(2010). Nutrition26:482 - 490];能量动态平衡方面：血楽中亮氨酸、异亮氨 酸和缬氨酸的上升可能引起颅内压的升高和脑氧消耗量的降低[参考文献3 :Raphael N，Vuille-Dit-Bille, Riem Ha-Huy. Amino Acids (2012)43:1287 - 1296];信号传导方面： 苯丙氨酸和酪氨酸是合成去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴的胺兴奋神经传导物质的前驱物 [参考文献 4 :Fernstrom JD, Fernstrom MH. J Nutrl37 ((6Suppll)) : 1539S - 1547S];同时， 苯丙氨酸和酪氨酸经脱羧作用生成苯乙胺和酪胺，当肝功衰竭时不经肝内分解进入而脑组 织，则可经经非特异性的β羟化酶作用分别形成苯乙醇胺和β羟酪胺，它们的化学结构与 儿茶酚胺相似，是假神经递质。假神经递质增多，可取代正常递质儿茶酚胺，但它们不能传 递神经冲动，可使大脑发生异常抑制，这可能与肝昏迷的症状有关；鉴于此，检测血清中胺 类代谢物的变化有助于我们了解肝性脑病的代谢谱，以便开发和建立更有效的早期肝性脑 病诊断方法。
[0004] 目前，检测胺类物质的方法有：高效离子交换色谱法、毛细管电泳技术、气相色谱 法和液相色谱法及其联用的紫外吸收、质谱等。高效离子交换色谱法对氨基酸检测专一 性强，但分析成本高，工作效率低[参考文献5 :Moore S，Spackmand Η，Stein W Η. Anal. Chem.，1958, 30(7) :1185-1190)];毛细管电泳技术具有高效快速灵敏进样少成本低等优 点，但是其重现性较差[参考文献 6 :Poinsot V，Carpene M A, Bouajila J. Electrophoresi s，2012, 33 (1) : 14-35.];气相色谱法柱效高、快速易与质谱仪联用等优点，但该方法衍生条 件苛刻，不同胺类物质衍生反应速度不同或者衍生化试剂也不同，操作过程繁琐且易带来 污染[参考文献 7 :Khuhawar M Y, Majidano S A. Chromatographia, 2011，73(7/8) :701-70 8.];高效液相色谱法，具有高效、简便、快速、准确和价格低廉等优点，特别是与质谱联用 后，其分析检测的灵敏度和分辨率显著提高，广泛应用于多种生物样品内胺类物质的检测 [参考文献 8 :Ran Liu, Qing Li, Ran Ma, Xiaohui Lin, Huarong Xu, Kaishun Bi. Analytica Chimica Acta791 (2013) 36 - 45]，但在常规液质联用方法中由于胺类物质极性强，出峰时间 快，离子抑制现象严重难以被检测。基于此，本试剂盒采用基于丹磺酰氯衍生血清中胺类物 质的液质联用的方法，大大减弱了胺类物质的离子抑制现象，改善了分离度，明显地增强了 检测的灵敏度。并且本应用涉及的试剂盒可以检测到至少95种胺类物质，可以系统、全面 地监测早期肝性脑病血清胺类物质代谢谱的变化，为早期HE的机理解释和诊断提供新的 途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对早期肝性脑病隐蔽性强而诊断困难的问题，发现了一种新的 组合的能够应用于早期肝性脑病诊断，上述组合胺类标志物的特征和检测方法如下：
[0006] 本发明确定的5种胺类代谢物：天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸 和谷氨酰苯丙氨酸都是人体中重要的代谢物，目前有研究表明，它们都涉及到肝性脑病的 发生和发展：鸟氨酸几乎涉及尿素循环的活化和氨的解毒的全过程，在此过程中形成精氨 酸，继而分裂出尿素形成鸟氨酸，鸟氨酸异常是由于尿素循环受阻引起；天冬氨酸参与肝细 胞内核酸的合成，间接参与三羧酸循环，促进肝细胞能量的合成，加速肝细胞恢复和再生， 提高肝细胞摄取、转化、排泄TBIL的能力及提高对血氨的解毒能力[参考文献9 :唐先明， 王谷丰.张永红等.临床消化病杂志，2004,16(3) :122-123.];在黄嘌呤氧化酶（主要来 自于肝细胞）氧化作用下，次黄嘌呤可转化为黄嘌呤，当肝细胞膜受损时会导致血清中次 黄嘌呤代谢异常；苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸则涉及到苯丙氨酸和谷氨酰胺的代 谢：苯丙氨酸是一种芳香族氨基酸，是形成假神经递质β苯乙醇胺的前体物质，同时有研 究表明，血浆中苯丙氨酸的升高对降低颅内压和增加脑氧消耗量有影响[参考文献10 :肝 性脑病诊断治疗专家委员会.中国肝脏病杂志.2009, 1(2) :46-55.];谷氨酰胺是氨解毒代 谢一谷氨酰胺合成的产物，其代谢可直接反映血氨的解毒情况。本发明首次将以上五种胺 类代谢物组合并应用在早期肝性脑病的诊断，所述胺类代谢组合标志物由基于丹黄酰氯衍 生技术的液相色谱质谱联用方法检测，方法用如下：
[0007] 分离系统为Waters超高效液相色谱，色谱柱为C18,流动相流速为0· 35ml/min， 柱温为60摄氏度，进样量为IOul (也可使用C8色谱柱，柱温为25-60摄氏度，流速为 0. 2-1.0ml/min但因这些条件分离速度慢且各胺类物质分离度较差而未被采用）；洗脱液 为A相0.1% (v/v)甲酸的水溶液、B相0.1% (v/v)甲酸的乙腈溶液（也可以选择0.1% (v/V)甲酸的水溶液和乙腈（甲醇）溶液洗脱液，但灵敏度相对要低些）；内标通常选择为 胺类同位素也可采用其他质谱检测常用内标如亮氨酸脑菲肽等。检测器采用的质谱为高分 辨的线性离子阱-轨道阱质谱（LTQ Orbitrap MS)，正离子模式检测。
[0008] 血清样本预处理方法：
[0009] 血样在4 °C下解冻，取100 μ L血清样本，加入400 μ L含有多个内标的乙腈提 取液沉淀蛋白：涡旋30-90s，静置15-30mins后，4°C条件下10000-14000rpm转速离心 10-15mins，取上清冷冻干燥；干燥后的粉末样品进行丹黄酰氯衍生，步骤如下：加5mg/mL 丹磺酰氯乙腈溶液50uL和0. 15M的碳酸钠和碳酸氢钠的混合水溶液50uL，涡旋30-60s，封 膜，放置60摄氏度水浴震荡50mins，去膜，再加入0. 5M 丁胺水溶液30uL，60摄氏度水浴震 荡40mins除去未反应完的丹磺酰氯，水浴后离心，取上清进样。通过总离子流图计算内标 峰、五种胺类代谢物的峰面积，以确定五种胺类代谢物的相对含量。提取剂中内标及其浓度 见附表1。
[0010] 所获得数据通过SPSS软件进行二元逻辑回归分析：在三类样本中，每类随机挑出 2/3的样本作为训练集用于建模，剩余的1/3样本作为测试集用于验证。所建模型获得的回 归方程如下：
[0011] X = 56. 712*Α-3· 559*Β-69· 638*0280. 485*D+14. 578*Ε-4· 209
[0012] Prob (早期肝性脑病）=l/(l+e χ)
[0013] 其中A、B、C、D、E分别为谷氨酰苯丙氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸、D为次黄嘌 呤、E为天冬氨酸的相对浓度，Prob (早期肝性脑病）为肝性脑病的概率，Cutoff = 0. 36， 即当Prob (早期肝性脑病）值大于0. 36时，诊断为早期的肝性脑病。
[0014] 所建模型对非早期肝性脑病和早期肝性脑病具有良好的判别能力（见图2、3)，组 合标志物的AUC = O. 954、灵敏度为86. 7%、特异性为87. 5% (见表2);同时，在训练集中干 扰组和早期肝性脑病的正确诊断率分别为87. 5%和86. 7%，测试集中均为87. 5%。此外， 组合标志物在血氨假阴性（<60um〇l/l)的早期肝性脑病患者中的诊断准确率为85% (见 图4);优异的ROC曲线结果和训练集、测试集中良好的正确诊断率以及和传统肝性脑病标 志物良好的互补性表明五种胺类组合标志物具有为早期肝性脑病诊断的潜力。
[0015] 本发明具有的效果是：血清样品中胺类代谢物天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙