氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸可以联合用于早期肝性脑病病人的识别。通过本发明涉及 的组合标志物，能够对早期肝性脑病的诊断具有高灵敏、高特异性特征。同时，该组合标志 物可以与传统的标志物血氨互补，联合使用能够用于早期肝性脑病的辅助诊断。
【附图说明】
[0016] 图1为天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸在正常 对照组、肝硬化组和肝性脑病早期组血清样本中的含量变化（均值土标准偏差表示）；
[0017] 图2为联合标志物及其单个标志物在判别早期肝性脑病组和干扰组一正常对照 组及肝硬化组的ROC曲线；
[0018] 图3为联合标志物在判别早期肝性脑病组和干扰组-肝硬化组的诊断结果图；
[0019] 图4为联合标志物和血氨在判别早期肝性脑病组和干扰组-肝硬化组的诊断正确 率比较图。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1
[0021] 1.血清样品收集采集前，纳入志愿者签署知情同意书。
[0022] 肝硬化组纳入标准：参照2010年修订慢性乙型肝炎防治指南[11]。
[0023] 早期肝性脑病纳入标准：选择了至少接受过5年教育的肝硬化患者作为研究对 象，其中数字连接试验-A、数码-符号试验或脑电图三者诊断中至少一项异常，则诊断为早 期肝性脑病。
[0024] 健康对照组纳入标准：正常体检人群（40 - 70岁之间），体检身体健康者。
[0025] 相同条件下采用血清样本：33例正常人、15例肝硬化和23早期肝性脑病（0期11 例、I期12例）患者的血清样本；入院后24小时内留取患者空腹抗凝血及促凝血各4ml，半 小时之内分离血清，置于_80°C冰箱保存，备检。
[0026] 2.分析方法
[0027] 2. 1血清样本预处理
[0028] 血样在4 °C下解冻，取100 μ L血清样本，加入400 μ L含有多个内标的乙腈提 取液沉淀蛋白：涡旋30-90s，静置15-30mins后，4°C条件下10000-14000rpm转速离心 10-15mins，取上清冷冻干燥；干燥后的粉末样品进行丹黄酰氯衍生，步骤如下：加5mg/ mL丹磺酰氯乙腈溶液50uL和0· 15mol/L的碳酸钠和0· 15mol/L的碳酸氢钠的混合水溶 液50uL，涡旋30-60s，封上封□膜，放置60摄氏度水浴震荡50mins，去上封□膜，再加入 0. 5mol/L 丁胺水溶液30uL，60摄氏度水浴震荡40mins除去未反应完的丹磺酰氯，水浴后离 心，取上清，以待进样。提取液中加入的同位素内标及相应的浓度见表1。
[0029] 表1内标及其在乙腈提取液中的浓度
[0030]
[0031 ] 2. 2超高效液相色谱质谱分析
[0032] (1)液相条件：色谱仪为Waters AcQuity超高效液相色谱（Waters, Ireland);色 谱柱为 Waters ACQUITY UPLCOBEH C18 (I. 7um，2. Imm XlOOmm) (Waters, Ireland);流动相 A 为流动相：A相为含0. 1% (v/v)甲酸水溶液，B相为0. 1% (v/v)甲酸乙腈溶液；洗脱梯度： O-Imin为2% B相，lmin-20min线性变化到80% B相，20min-25min线性变化到100% B相， 保持4min，0.1 min内线性降至2% B相并保持Imins ;柱温为60°C ;流动相流速为0. 35mL/ min ;进样量为10 μ L。
[0033] (2)质谱条件：质谱仪为线性离子阱-轨道阱质谱（LTQ Orbitrap MS) (Thermo，USA);采用正离子模式检测；扫描范围：m/z80-1000 ;毛细管温度为300°C，喷雾电 压为4. 5kV，鞘流气为35arbitrary units,辅助气流为5arbitrary units ;分辨率为60000。
[0034] 2. 3血清测试结果及辅助诊断方法
[0035] 对于正常对照组和肝硬化组，鸟氨酸和谷氨酰苯丙氨酸在早期肝性脑病组中显著 性升高，天冬氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸则显著性下降（见图1)。同时，将各标志物 的含量带入回归方程式中，计算出概率，采用的cutoff值为0. 36,即组合标志物的概率大 于0. 36则认为是早期肝性脑病（图2)，组合标志物的AUC = 0. 954,灵敏度和特异性也比 较高，分别为86. 7%和87. 5% (见表2)。而常用的肝性脑病床标志物血氨在早期肝性脑病 组也有低于诊断cutoff值^Omol/L)的假阴性样本（23例肝癌样本中有20例血氨值小于 60mol/L)。进一步分析此结果，早期肝性脑病中，23例肝癌患者中有20例呈阴性反应（血 氨<60mol/L)，而采用组合标志物法来对这20例病人进行诊断时，发现其中17例呈阳性反 应（概率>0.36)。这说明组合标志物与血氨具有较好的互补性（见图4)，两者进行联合诊 断更有助于提高检测早期肝性脑病的能力。
[0036] 表2各标志物及其组合在非肝性脑病组和早期肝性脑病组中的灵敏度和特异性
[0037] -
[0038]
[0039] 本发明所述试剂盒具有检测成本低，稳定性好的特点。同时，本发明可应用于辅助 早期肝性脑病的临床诊断，有诊断特异性高和灵敏度高的特点，并与传统的临床诊断标志 物血氨相互补充的特点，具有较高的开发应用的价值。
【主权项】
1. 组合型胺类代谢标志物的应用，即组合型胺类代谢标志物在制备用于诊断受试者中 的早期肝性脑病患者的试剂盒的用途，所述组合标志物由天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯 丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸共同构成。2. -种检测受试者中的早期肝性脑病的试剂盒，所述试剂盒包括： (1) 标准品：天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸，所述 标准品分别用于对应的血清中胺类代谢物天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸 和谷氨酰苯丙氨酸的定性； (2) 含内标的提取液：所述提取液用于预处理来自受试者的血清样品，为包含至少一 种内标物的乙腈溶液，含内标的提取液为：l_5ug/ml稳定同位素标记的色氨酸、l-5ug/ml 稳定同位素标记的丙氨酸、l_5ug/ml稳定同位素标记的亮氨酸和l-5ug/ml稳定同位素标 记的胸腺嘧啶中一种或二种以上的乙腈溶液； (3) 衍生化试剂：5mg/ml丹磺酰氯乙腈溶液、0? 5mol/L 丁胺水溶液和0? 15mol/L的碳 酸钠和0. 15mol/L的碳酸氢钠的混合水溶液； (4) 洗脱液：0.1% (v/v)甲酸的水溶液和0.1% (v/v)甲酸的乙腈溶液。3. 根据权利要求2所述试剂盒，其中受试者包括早期肝性脑病患者，及对照的肝硬化 患者和/或正常人。4. 一种计算受试者的血清样品中的组合标志物变量的方法，所述组合标志物由天冬氨 酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸共同构成，所述方法包括以下 步骤： 1) 以含有内标物的提取液处理来自受试者的血清样本，沉淀血清蛋白后，提取上清、 冻干；随后对冻干的粉末进行2步丹磺酰氯衍生法衍生，步骤如下：加5mg/mL丹磺酰氯 乙腈溶液50uL和0? 15mol/L的碳酸钠和0? 15mol/L的碳酸氢钠的混合水溶液50uL，涡旋 30-60s，封上封口膜，放置60摄氏度水浴震荡50mins，去上封口膜，再加入0. 5mol/L 丁胺水 溶液30uL，60摄氏度水浴震荡40mins除去未反应完的丹磺酰氯，水浴后离心，取上清，采用 质谱正离子模式检测分析； 2) 在液相色谱-质谱分析获得的总离子流图上，提取天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、 苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸衍生后所对应离子的色谱峰；天冬氨酸衍生后离 子的提取参数为：质核比为367. 0962±0. 005的离子，鸟氨酸衍生后离子的提取参数 为：599. 1995±0. 005的离子，次黄嘌呤衍生后离子的提取参数为：370. 0972±0. 005的离 子，苯丙氨酰苯丙氨酸衍生后离子的提取参数为：546. 2061 ±0. 005的离子，谷氨酰苯丙氨 酸衍生后离子的提取参数为：759. 2449 ±0. 005的离子； 3) 以试剂盒中五种胺类物质天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰 苯丙氨酸的标准品对检测到的离子进行定性；将浓度为4-50ug/ml的五种胺类物质标准品 水溶液在步骤1)相同条件下衍生后，进行液相色谱-质谱分析，确定五种标准品衍生后对 应离子的保留时间以及实测质核比，与在受试者样本中实测的五种物质相比较； 4) 对每一受试者样本中经定性后的五种物质的色谱面积分别与提取液中的内标物比 较，获得天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸的相对浓度； 5) 以上述五种胺类代谢物的相对浓度值，基于二元逻辑回归方程计算组合标志物变量 Po
【专利摘要】本发明涉及了血清中胺类代谢物：天冬氨酸、鸟氨酸、次黄嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸，作为组合标志物在制备用于诊断受试者中的早期肝性脑病患者的试剂盒中的新应用。本发明还涉及检测受试者中的早期肝性脑病患者的试剂盒，通过检测来自受试者的血清中上述胺类组合标志物各自的相对浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述组合标志物变量Prob以及判断截点值(cutoff)，判断所述受试者是否是早期肝性脑病患者。所述试剂盒具有检测成本低，稳定性好的特点。同时，本发明可应用于辅助早期肝性脑病的临床诊断，有诊断特异性高和灵敏度高的特点，并与传统的临床诊断标志物血氨相互补充的特点，具有较高的开发应用的价值。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN105092753
【申请号】CN201410213947
【发明人】许国旺, 罗萍, 尹沛源, 黄强
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月20日