专利名称：骨代谢异常症治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及活性及活性持续性高的新型骨代谢异常症治疗剂。本发明的骨代谢治疗剂对骨质疏松症、高钙血症、慢性关节风湿病等骨代谢异常症具有优异的治疗活性，是有用的医药品。
背景技术：
骨骼不仅具有支持机体的能力，而且是机体内钙的最大储存脏器，机体中所存在钙的99％储存于骨骼中。而且，骨骼不断地受到骨吸收和骨形成这两种相反的作用，在保持血清钙的稳定性上起着重要的作用。已知在骨吸收上起重要作用的破骨细胞活化时，过量钙从骨骼向血液中流出，破坏血液中钙的稳定性，引起高钙血症。高钙血症是因癌的骨转移等而发生的疾病，预期其患者数目将增加，急需开发该疾病的治疗剂。目前，作为这种高钙血症治疗剂而使用的有降钙素及其衍生物或双膦酸类化合物。然而，它们的治疗效果并不令人满意，因而期望开发取代它们的新型药物。
另一方面，据报告，已知作为抑制破骨细胞分化的蛋白因子的破骨细胞形成抑制因子(OCIF)(WO96/26217号公报)具有降低血清钙的作用(BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS,Vol.245,pp382-387(1998)；Endocrinology,Vol.139,pp4012-4015(1998))。OCIF可望成为全新的高钙血症治疗剂，但因为OCIF是蛋白质，所以在体内迅速代谢。因此，期望开发较稳定的、作用强的OCIF制剂。
发明的揭示本发明者们鉴于上述情况进行锐意研究的结果，发现通过在OCIF中加入多糖类制成制剂，可进一步增强OCIF所具有的对骨代谢异常症的效果。从而，本发明的课题是提供进一步增强OCIF对骨代谢异常症的效果并使该效果持续的骨代谢异常症治疗剂。
本发明涉及选自破骨细胞形成抑制因子(OCIF)、其类似物或其变体的一种以上物质与多糖类或其衍生物组成的骨代谢异常症治疗剂。
本发明中的上述多糖类较佳为肝素，上述多糖类衍生物较佳为硫酸葡聚糖。
本发明提供了对骨质疏松症、高钙血症、慢性关节风湿病等骨代谢异常症具有优异的治疗活性且活性持续的治疗剂，作为医药品是有用的。
本发明还涉及用多糖类或其衍生物提高破骨细胞形成抑制因子活性的方法。
本发明中所用的OCIF是用例如WO96/26217号公报记载的方法所得的天然型或基因重组型OCIF，其来源无特殊限制，特别可取的是人型OCIF。这样的天然型或基因重组型OCIF是在非还原条件下用SDS-PAGE测定分子量约为60kDa的单体型或分子量约为120kDa的二聚物型。
本发明中也可使用OCIF的类似物或变体。类似物有例如从用IMR-90细胞(ATCC CCL-186)的聚(A)+RNA制成的cDNA文库中，将OCIFcDNA片段作为探针用杂交法得到的OCIF类似物的cDNA插入表达载体，将此载体引入常用的宿主，在宿主中表达，用常规方法精制而成的类似物。较具体的有WO96/26217号公报上记载的OCIF2、OCIF3、OCIF4和OCIF5。
如WO96/26217号公报所述，OCIF2系OCIFcDNA碱基序列265位鸟嘌呤至285位鸟嘌呤的21个碱基对缺失，在氨基酸序列上OCIF的氨基酸序列68位谷氨酸(Glu)至74位谷氨酰胺(Gln)的7个氨基酸缺失。
OCIF3系将OCIFcDNA碱基序列9位胞苷替换为鸟嘌呤，在氨基酸序列上，将OCIF氨基酸序列的19位天冬酰胺(Asn)替换为赖氨酸(Lys)。但是，这是信号序列中氨基酸的取代，被认为对分泌的OCIF3无影响。而且，OCIFcDNA碱基序列872位鸟嘌呤至988位鸟嘌呤的117个碱基对缺失，在氨基酸序列上，OCIF的氨基酸序列270位苏氨酸(Thr)至308位亮氨酸(Leu)的39个氨基酸缺失。
OCIF4系将OCIFcDNA碱基序列9位胞苷替换为鸟嘌呤，在氨基酸序列上，将OCIF氨基酸序列的-19位天冬酰胺(Asn)替换为赖氨酸(Lys)；又将22位鸟嘌呤替换为胸苷，在氨基酸序列上，将OCIF的氨基酸序列-14位丙氨酸(Ala)替换为丝氨酸(Ser)。但是，这是信号序列中氨基酸的取代，被认为对分泌的OCIF4无影响。而且，OCIFcDNA碱基序列400位至401位之间插入约4kb的内含子2，开放读框终止于此。在氨基酸序列上，OCIF的氨基酸序列112位丙氨酸(Ala)后加上21个氨基酸组成的新氨基酸序列。
OCIF5系将OCIFcDNA碱基序列9位胞苷替换为鸟嘌呤，在氨基酸序列上，将OCIF氨基酸序列的一19位天冬酰胺(Asn)替换为赖氨酸(Lys)。但是，这是信号序列中氨基酸的取代，被认为对分泌的OCIF5无影响。而且，OCIFcDNA碱基序列400位至401位之间插入约1.8kb的内含子2的后半部分，开放读框终止于此。在氨基酸序列上，OCIF的氨基酸序列112位丙氨酸(Ala)后加上12个氨基酸组成的新氨基酸序列。
作为变体，可列举对OCIF的氨基酸序列插入、添加、取代或缺失一个以上氨基酸而得到的物质。较具体的是，将OCIFcDNA用PCR法或用限制酶切断，制成引入取代或缺失变异的OCIF变体cDNA，将此cDNA插入表达载体，将载体引入常用宿主，在宿主中表达，用常规方法精制而成。
本发明中所用的多糖类是单糖通过糖苷键生成的聚合物(葡聚糖)，较佳为两种以上结构单糖构成的杂多糖(杂聚糖)。具体地说，可使用天然多糖类，例如透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、角叉菜胶、果胶和肝素；合成多糖类，如葡聚糖等；及合成多糖类的衍生物，如硫酸葡聚糖等。特别好的是使用硫酸酯化的葡聚糖，例如可使用分子量3,000～6,000的肝素或分子量5,000～10,000的硫酸葡聚糖。本发明的骨代谢异常症治疗剂由选自OCIF、其类似物或其变体的一种以上物质与多糖类或其衍生物组成，相对于OCIF、其类似物或其变体，多糖类或其衍生物的比例较佳为1～100倍量，特别好的是1～16倍。由选自OCIF、其类似物或其变体的一种以上物质与多糖类或其衍生物组成的本发明的骨代谢异常症治疗剂作为持续性和治疗效果优于OCIF单独给药的骨代谢异常症治疗剂，对诸如骨质疏松症、高钙血症、慢性关节风湿病等骨代谢异常症均有效。
本发明的制剂可经口或非经口地安全地对人和动物投药。非经口投药可列举如静脉注射、肌肉注射、皮下注射、经鼻给药、口腔内给药、经粘膜给药等。以这些给药途径给药的制剂可按各自的制剂学方法作成制剂，与药理学上允许的载体、赋形剂、润滑剂、着色剂等一起，作为药物组合物的形式给药。制备注射剂时，除OCIF及多糖类外，根据需要添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、加溶剂等，按常规方法制成注射剂。其中也可合用人血清白蛋白和表面活性剂等公知的添加剂。表面活性剂可列举如聚阴离子和阴离子表面活性剂等。注射剂分注入小瓶，成为溶液制剂，或形成冷冻干燥制剂，使用时可用适量蒸馏水和生理盐水等溶解，进行配制。将OCIF以3或24mg/kg的用量给正常大鼠静脉注射，一天一次，连续2周，证实骨密度和骨量增加，但未观察到38个组织中组织病理学的异常和血球数的变化(H.Yasuda等Endocrinology,Vol.139,pp1329-1337(1998))。因此，OCIF的作用对骨骼特异性高，可望能安全地给人投药。
本发明的骨代谢异常症治疗剂对患者投药时，给药量和给药方法随症状的程度、患者的年龄、健康状况、体重等条件而变化，无特别限定，但较佳为成人每天0.01～1mg/kg，非经口给药，一天一次至几次。本发明制剂的活性可通过血清钙浓度的测定而确定。在用适当的溶剂配制的OCIF溶液中添加多糖类，给大鼠静脉注射，按时采血，可按常规方法进行血清钙浓度测定。
本发明还涉及用多糖类或其衍生物提高破骨细胞形成抑制因子活性的方法。按照本发明，可升高OCIF的血浓度，增强OCIF降低血清钙浓度的作用。
附图的简单说明
图1显示实施例2中在OCIF中添加多糖类的制剂给药3小时后的血清钙浓度。
符号的说明D-1:OCIF0.5mg/kg+硫酸葡聚糖(分子量5,000)2mg/kgD-2:OCIF0.5mg/kg+硫酸葡聚糖(分子量8,000)2mg/kgD-3:OCIF0.5mg/kg+硫酸葡聚糖(分子量10,000)2mg/kgH-1:OCIF0.5mg/kg+肝素(207.8单位/mg)2mg/kgH-2:OCIF0.5mg/kg+肝素(171.2单位/mg)2mg/kgH-3:OCIF0.5mg/kg+肝素(分子量3,000)2mg/kgH-4:OCIF0.5mg/kg+肝素(分子量6,000)2mg/kg**差异有意义(p≤1％)。
图2显示实施例3中改变OCIF和多糖类的混合比给药后3小时的血清钙浓度。
符号的说明**差异有意义(p≤1％)。
图3显示实施例4中在OCIF中添加多糖类的制剂给药后3、6、9小时的血清钙浓度。
符号的说明**差异有意义(p≤1％)。
图4显示实施例5中在OCIF中添加多糖类的制剂给药后经时性的血中OCIF的浓度变化。
符号的说明A显示二聚物型OCIF的血浓度；B显示单体型OCIF的血浓度；●OCIF；○OCIF+硫酸葡聚糖。
图5显示实施例5中在OCIF中添加多糖类的制剂给药后单体型/二聚物型OCIF在血中比例的经时性变化。
符号的说明A:OCIF；B:OCIF+硫酸葡聚糖；○二聚物型OCIF；△单体型OCIF。
图6显示实施例6中在OCIF中添加多糖类(硫酸葡聚糖、苹果果胶或橘皮类果胶)的制剂给药2小时和4小时后血中OCIF的浓度。
符号的说明□0.5mg/kg OCIF单独给药；◇0.5mg/kg OCIF+0.5％硫酸葡聚糖；○0.5mg/kg OCIF+0.5％苹果果胶；△0.5mg/kg OCIF+0.5％橘皮类果胶。
图7显示实施例6中在OCIF中添加多糖类(硫酸葡聚糖、苹果果胶或角叉菜胶)的制剂给药2小时和4小时后血中OCIF的浓度。
符号的说明□0.5mg/kg OCIF单独给药；◇0.5mg/kg OCIF+0.5％硫酸葡聚糖；○0.5mg/kg OCIF+0.5％苹果果胶。
图8显示实施例7中在OCIF中添加多糖类(硫酸葡聚糖或苹果果胶)的制剂静脉注射后血中OCIF的浓度。
符号的说明○50μg/kg OCIF单独给药；△50μg/kg OCIF+0.1％硫酸葡聚糖；□50μg/kg OCIF+0.15％苹果果胶。
图9显示实施例7中在OCIF中添加多糖类(硫酸葡聚糖或苹果果胶)的制剂肌肉注射后血中OCIF的浓度。
符号的说明○1mg/kg OCIF单独给药；△1mg/kg OCIF+0.1％硫酸葡聚糖；□1mg/kg OCIF+0.15％苹果果胶。
图10显示实施例8中在OCIF中添加多糖类(苹果果胶)的制剂给药4小时后的血清钙浓度。
实施发明的最佳状态实施例以下用实施例对本发明作具体的描述，但它们仅仅是具体的举例说明，本发明并不受它们的任何限制。
实施例1注射剂的制造·1将按WO96/26217号公报中记载的方法所得的人OCIF500μg和肝素2mg溶于含0.15M NaCl和0.01％吐温80的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)5ml中，将此溶液经0.22μm灭菌滤器(Millex GV,Millipore公司)灭菌后，充填在小瓶中，得到静脉注射用注射剂。
注射剂的制造·2将按WO96/26217号公报中记载的方法所得的人OCIF500μg和硫酸葡聚糖2mg溶于含0.15M NaCl和0.01％吐温80的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)5ml中，将此溶液经0.22μm灭菌滤器(Millex GV,Millipore公司)灭菌后，充填在小瓶中，得到静脉注射用注射剂。
实施例2添加多糖类的OCIF降低血清钙浓度的效果·1将人OCIF(二聚物型)(按WO96/26217号公报中记载的方法所得的重组OCIF)溶于含0.15M NaCl和0.01％吐温80的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)(以下简称溶剂)中，配制成0.25mg/ml的溶液，在此溶液2ml中，溶解硫酸葡聚糖(分子量8000或10000,Sigma AB制；分子量5000或50000，和光纯药社制)或肝素(207.8或171.2单位/mg，和光纯药社制；分子量3000或6000，Sigma AB制)2mg，然后于4℃放置一昼夜。同时将人型OCIF0.25mg/ml和2.5mg/ml溶液和溶剂于4℃放置一昼夜。将这些试样液分别配制用于OCIF+硫酸葡聚糖给药组(D组)、OCIF+肝素给药组(H组)(D组和H组按OCIF量计给药0.5mg/kg)、OCIF单独给药组(按OCIF量计给药0.5mg/kg和5mg/kg)及给予溶剂组。4周龄雌性Wistar大鼠以2ml/kg的用量静脉内给药一次。给药3小时后进行眼眶取血，制成血清，用钙C试验(和光纯药社)测定所得血清中的钙浓度。结果如图1所示。该结果表明，添加各种类型的硫酸葡聚糖或肝素的0.5mg/kg人OCIF给药后，有明显的对血清钙浓度降低的增强效应。从而确认添加多糖类可增强人OCIF的降低血清钙浓度的作用。
实施例3与多糖类添加量有关的OCIF作用的增强效果在与实施例2同样制得的人OCIF0.25mg/ml溶液2ml中，溶解相对于人OCIF1、2、4、8、16倍重量的硫酸葡聚糖(分子量5000，和光纯药社)，4℃放置一昼夜。同样地，按相同的比例在人型OCIF0.25mg/ml溶液2ml中，溶解肝素(207.8单位/mg，和光纯药社)，4℃放置一昼夜。
再将配制成4mg/ml的硫酸葡聚糖或肝素溶液、配制成0.25和2.5mg/ml的人OCIF溶液及单纯溶剂同样地于4℃放置一昼夜。将此试样液以2ml/kg的用量给4周龄雌性Wistar大鼠静脉内给药一次。给药3小时后进行眼眶取血，制成血清，用钙C试验(和光纯药社)测定所得血清中的钙浓度。此药盒按螯合法(邻甲酚酞配位酮法，orthocresol phthalein coplexon(OCPC)法)添加8-羟基喹啉除去镁的影响，提高特异性，因此在碱性条件下与OCPC结合呈紫红色，测定其吸光度，可测得钙的浓度。结果如图2所示。该结果表明，以人OCIF4倍量以上添加硫酸葡聚糖后，有明显的降低血清钙浓度的作用。而以人OCIF等量添加肝素后也有显著的降低血清钙浓度的作用。从而确认以特定的比例同时给予人OCIF和多糖类可增强OCIF的降低血清钙浓度的作用。
实施例4添加多糖类持续增强OCIF的效果在以溶剂配制的人OCIF2.5mg/ml溶液2ml中溶解硫酸葡聚糖(分子量5000，和光纯药社)20mg后，于4℃放置一昼夜。将肝素(207.8单位/mg，和光纯药社)20mg也溶于人OCIF2.5mg/ml溶液2ml中，同样地于4℃放置一昼夜。再将配制成2.5mg/ml的人OCIF及溶剂也于4℃放置一昼夜。将所得试样液以2ml/kg(以OCIF计为5mg/kg)的用量分别给4周龄雌性Wistar大鼠静脉内给药一次。给药3、6、9小时后进行眼眶取血，制成血清，用钙C试验(和光纯药社)测定所得血清中的钙浓度。结果如图3所示。该结果表明，5mg/kg人OCIF溶液单独给药组给药3小时后，血清钙浓度明显降低，给药6和9小时未见血清钙浓度降低作用。
另一方面，以人OCIF4倍量添加硫酸葡聚糖或肝素的2.5mg/ml人OCIF溶液给药9小时后，有明显的降低血清钙浓度的作用。从而确认同时给予人OCIF和多糖类可得到持续性增强效果。
实施例5添加多糖类对血中OCIF浓度的持续效果·1在与实施例2同样配制的人OCIF 1mg/ml溶液1ml中，加入4mg/ml硫酸葡聚糖溶液1ml,4℃放置一昼夜。将此试样液以1ml/kg的用量给9周龄雄性Wistar大鼠静脉内给药一次。给药2、5、10、15、30、45、60、120、240、360、480、600、720和1440分钟后进行眼眶取血，制成血清，用识别二聚物型OCIF的单克隆抗体、识别单体型OCIF的单克隆抗体(BIOCHEMICAL ANDBIOPYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS,Vol.245,pp382-387(1998))，按WO96/26217号公报记载的ELISA法测定所得血清中的人OCIF浓度。求出OCIF总浓度，为二聚物型OCIF浓度和单体型OCIF浓度之和。结果如图4和图5所示。其结果，与500μg/kg人OCIF溶液单独给药组相比，添加了相当于人OCIF4倍量的硫酸葡聚糖的人OCIF溶液给药组明显地维持血中高浓度OCIF(图4)。并且，确认血中二聚物型OCIF向单体型OCIF的转化受到抑制(图5)。因此，通过添加多糖类，维持了OCIF血浓度、特别是降低血清钙浓度活性高的二聚物型OCIF(BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS,Vol.245,pp382-387(1998))的血浓度。
实施例6添加多糖类对血中OCIF浓度的持续效果·2在与实施例2同样配制的人OCIF0.25mg/ml溶液2ml中，等量混合硫酸葡聚糖、苹果果胶或橘皮类果胶(均为和光纯药社制)的0.5％溶液(溶剂含0.15M NaCl、0.01％聚山梨酯80的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0))，室温放置4小时，制成试样液。另仅将0.25mg/ml OCIF溶液(2ml)与溶剂同样等量混合，室温放置4小时，作为对照。将这些试样液以2ml/kg的用量给4周龄的雄性Wistar大鼠静脉注射一次，给药2、4小时后在乙醚麻醉下进行眼眶采血，制成血清。用WO96/26217号公报记载的ELISA法测定所得血清中的人型OCIF浓度。结果见图6。
用与前述同样的方法，在人OCIF0.25mg/ml溶液2ml中，等量混合硫酸葡聚糖、苹果果胶或角叉菜胶(λ)(均为和光纯药社制)的0.5％溶液，室温放置4小时，制成试样液。另仅将0.25mg/ml OCIF溶液与溶剂同样等量混合，室温放置4小时，作为对照。将这些试样液以2ml/kg的用量给4周龄的雄性Wistar大鼠静脉注射一次，给药2、4小时后在乙醚麻醉下进行眼眶采血，制成血清。用WO96/26217号公报记载的ELISA法测定所得血清中的人型OCIF浓度。结果见图7。
结果，与人型OCIF单独给药组相比，添加硫酸葡聚糖、苹果果胶或橘皮类果胶的试样给药组明显地维持OCIF高血浓度(图6)。添加角叉菜胶的试样给药组也同样明显地维持OCIF高血浓度(图7)。从而，确认了通过添加这些多糖类可维持OCIF的血浓度。
实施例7添加多糖类对血中OCIF浓度的持续效果·3用硫酸葡聚糖或苹果果胶(和光纯药社制)作为多糖类，研究不同给药途径维持OCIF血浓度的效果。用溶剂(含0.15M NaCl、0.01％聚山梨酯80的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0))将人OCIF配制成按静脉注射用为50μg/ml、肌肉注射用为1000μg/ml的稀释的OCIF溶液，加入上述多糖类，分别制成试样液。在其中，在静脉注射用或肌肉注射用的OCIF溶液中分别添加硫酸葡聚糖使其成为0.1％的溶液。苹果果胶则以溶剂溶解，配制成3mg/ml溶液，将此溶液与静脉注射用或肌肉注射用的OCIF溶液(分别含有100μg/ml和2000μg/mlOCIF)等量混合。将这些溶液以1ml/kg的用量给4周龄的雄性Wistar大鼠一次给药，静脉注射后2、5、10、15、30、45、60、120、240、360分钟后，肌肉注射30分钟、1、2、3、4、5、6、8、10、24小时后，分别在乙醚麻醉下进行眼眶采血，制成血清。用WO96/26217号公报记载的ELISA法测定所得血清中的人型OCIF浓度。结果见图8和图9。
结果，添加硫酸葡聚糖或苹果果胶的OCIF溶液静脉注射(图8)或肌肉注射(图9)能明显地维持OCIF高血浓度。从而，确认了通过添加这些多糖类可维持OCIF的血浓度，而且不论何种给药途径均观察到维持OCIF血浓度的效果。
实施例8添加多糖类的OCIF降低血清钙浓度的效果·2在与实施例2同样配制的人OCIF0.25mg/ml溶液2ml中，等量混合苹果果胶(和光纯药社制)的0.5％溶液(溶剂含0.15M NaCl、0.01％聚山梨酯80的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0))，室温放置4小时，制成试样液。同时，制备OCIF溶液(人OCIF 0.25mg/ml溶液2ml)与溶剂同样的等量混合物和单纯溶剂。将这些试样液以2ml/kg的比例给4周龄的雄性Wistar大鼠静脉注射一次，给药4小时后在乙醚麻醉下进行眼眶采血，制成血清。用钙C试验(和光纯药社)测定所得血清中的钙浓度。结果如图10所示。该结果表明，单独给予0.5mg/kg人型OCIF的组未见血清钙浓度降低作用，而添加苹果果胶的0.5mg/kg人型OCIF给药组，有明显的血清钙浓度降低作用。从而确认添加多糖类可增强人型OCIF降低血清钙浓度的作用。
产业上利用的可能性本发明提供了选自破骨细胞形成抑制因子、其类似物或其变体的一种以上物质与多糖类或其衍生物组成的骨代谢异常症治疗剂。本发明提供了对骨质疏松症、高钙血症、慢性关节风湿病等骨代谢疾病具有优异的治疗活性并可长期维持活性的骨代谢异常症治疗剂，作为医药品是有用的。
权利要求
1．骨代谢异常症治疗剂，由选自破骨细胞形成抑制因子(OCIF)、其类似物或其变体的一种以上物质与多糖类或其衍生物所组成。
2．如权利要求1所述的骨代谢异常症治疗剂，其中OCIF是人OCIF。
3．如权利要求1所述的骨代谢异常症治疗剂，其中多糖类为肝素、果胶和/或角叉菜胶。
4．如权利要求1所述的骨代谢异常症治疗剂，其中多糖类衍生物为硫酸葡聚糖。
5．提高破骨细胞形成抑制因子活性的方法，其特征在于采用多糖类或其衍生物。
全文摘要
本发明提供骨代谢异常症治疗剂,选自破骨细胞形成抑制因子(OCIF)、其类似物或其变体的一种以上物质与多糖类或其衍生物组成的骨代谢异常症治疗剂。多糖类或其衍生物可使用肝素、硫酸葡聚糖等。本发明提供对骨质疏松症、高钙血症、慢性关节风湿病等骨代谢异常疾病具有优异的治疗活性并可长期维持活性的骨代谢异常症治疗剂。它们作为医药品是有用的。
文档编号A61P3/00GK1325310SQ99812828
公开日2001年12月5日 申请日期1999年10月28日 优先权日1998年10月28日
发明者望月伸一, 藤濑畅彰, 增山千春, 津田英资, 东尾侃二 申请人:雪印乳业株式会社, 三共株式会社