专利名称：一种评估孕前营养代谢遗传能力的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种评估孕前营养代谢遗传能力的试剂盒， 通过同时检测与孕前营养代谢遗传能力密切相关的5,10-亚甲基四氣叶酸还原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸 合成酶还原酶基因(MTRR)、维生素D受体基因(VDR)、 G蛋白P 3亚单位基因(GNB3)的单核苷酸多态性位 点基因型来评估孕前营养代谢遗传能力。
背景技术：
营养是人体健康的物质基础。孕前/围产期的营养尤其重要，因为它不仅影响孕妇的健康，而且还影 响到胎儿的正常发育以及出生后婴幼儿的体力和智力状况。有调査表明，孕前及妊娠期蛋白质的缺乏，不 利于胎儿中枢神经系统的发育和功能的健全，会使30%的幼儿出现精神或智力不正常，如反应迟钝，记忆 力差等。有人曾对唇裂婴儿的母亲进行了妊娠期营养调査，发现其中40%的母亲在妊娠期患有营养缺乏症， 60%的母亲患有不同程度的贫血。不仅如此，营养对妊娠期妇女自身的健康也是极为重要的。她们既要维持自身正常新陈代谢的需要， 又要保证充足的营养供给胎儿正常发育所需，因此需要充足且优质的饮食。充足优质的营养不仅可以减轻 妊娠初期的不适反应，还可以减少妊振后期发生某些疾病的可能，同吋对产后泌乳也是有益的。但是妊娠期和产后的营养补充也应适量，否则易增加产后肥胖的风险。产后肥胖正是目前大多数产妇 所面临的困扰问题之一。临床研究发现，妊娠过程中胎盘激素的变化，是造成产后肥胖的主要原因，这与 遗传因素密切相关，此外围产期营养过剩以及运动缺乏也是十分重要的原因。遗传体质不同的人存在营养素代谢能力的差异，因此不同身体状况与素质的育龄妇女必须根据自身情 况，有的放矢地准备与补充所需要的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质。因此，选取与育龄妇 女孕前/围产期以及胎儿发育营养代谢密切相关且研究明确的一些重要基因位点，综合利用现代科学研究 成果，开发一项基于分子遗传基础的营养素代谢能力评估及个性化干预提示产品，将能够对由f营养素代谢能力缺陷而影响母体及胎儿健康的情况以及由:p营养过剩而导致的产后肥胖风险增加起到预瞀和个性化防治作用，具有很强的社会意义和广阔的市场前景。目前，经证实并且机理研究清楚的与甲基类维生素代谢密切相关的基因有5,10-亚甲基四氢叶酸还 原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)。MTHFR为5， 10—methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH)(亚甲基四氣叶酸还原酶)蛋白编 码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5, 10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶 酸盐。5-甲基四氢叶酸盐可以进一步进入甲基传递通路,通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接的为DNA 甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一个较低的水平。研究发现，MTHFK 基因存在多种多态型，影响MTHFR活性和热稳定性。常见的变异包括(1) 677C-T: MTHFR基因第677位 密码子胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)替代，编码后酶分子中丙氨酸被缬氨酸替代，引起MTHFR热稳定性和活性 降低，相对于iE常的C/C基因型，纯合子T/T基因型MTHFR活性在37摄氏度降低50免 609&，在46摄氏度 降低65%; (2M298A-C:编码后酵分子中谷氨酸被丙氨酸替代，引起MTHFR活性降低。1298 A-C与677 C-T 不同的是，纯合子和杂合子血浆同型半胱氨酸升髙和叶酸降低均不明显。然而，如果同时存在1298 A-C 和677 C-T复合变异的杂合子，则MTHFR活性低于野生型40先。甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必需氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶(MTR编码)催化的， 而甲硫氨酸合酶因为辅助因子维生素B12被氧化而最终失活。MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过 还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。MT服能够保持甲基钴铵m在一定水平，而甲基 钴铵m是激活蛋氨酸合成酶的辅助因子，它可催化同型半胱氨酸再甲基化生成蛋氨酸。MTRR变异是造成叶 酸/甲基维生素缺乏症E型的主要原因。MTRR66A—G多态性，导致蛋氨酸被异亮氨酸替代，使该酶活性降 低。该棊因型对同型半胱氨酸水平有显著影响。有研究指出，MTRR基因A66G多态，血浆同型半胱氨酸增 高，基因型为MTRR 66GG， MTRR 66AG的孕妇或胎儿发生神经管畸形的危险性较正常对照组增加。目前，经证实并且机理研究清楚的与钙磷代谢密切相关的基因主要是维生素D受体(VDR)。VDR(vitaminD (1,25-dihydroxyvitaminD3) rec印tor)编码维生素D3的核激素受体，该蛋白也是胆石酸的第二受体。 VDR属于转录调控因子，为类固醇激素/甲状腺类激素受体超家族的成员。该蛋白对基因表达的调节主要通 过一系列代谢反应通路.包括免疫反应和肿瘤激活通路。该基因的多态性会导致维生素D缺乏引起的佝偻 病。目前报导的VDR基因多态性主要与rsl544410和rs731236单核苷酸多态性位点有关。妊娠过程中体内激素的变化，是造成产后肥胖的主要原因。G蛋白P3亚单位基因(GNB3)与产后肥胖 密切相关。GNB3为G蛋白P3亚单位编码基因，G蛋白是一种镶嵌于细胞膜上的异源三聚体，在细胞膜和 效应蛋白之间的信息传递过程中起"分子开关"作用，介导许多刺激血管活性和血管增生的细胞内效应。 G蛋白由a、 3和V亚单位组成，GNB3主要编译e亚单位。国内外多项研究表明，该基因上的多态现象与 高血压及其用药、肥胖、胰岛素抗性等都有相关性。发明内容基于5,10-亚甲基四氢叶酸还原嗨基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)、维生素D受体 基因(VDR)、 G蛋白P3亚单位基因(GNB3)上的6个SNPs位点多态性可用来评估孕前营养代谢遗传能力 的基础上，本发明提供一种评估孕前营养代谢遗传能力的试剂盒。该试剂盒包括检测5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性炎 光探针对；检测5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801131号SNP多态性基闲型的特异性引物对及特异性荧 光探针对；检测甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rs1801394号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；检测维生素D受体基因上rs731236号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测维生素D受体基因上rsl544410号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测G蛋白P 3亚单位基因上rs5443号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 荧光定量PCR反应组件(包括T叫酶、dNTP混合液、MgCh溶液、反应缓冲液、去离子水等)。本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号和 rsl801131号SNP位点、甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rsl801394号SNP位点、维生素D受体基因上rs731236 号和rsl544410号、G蛋白e 3亚单位基因上rs5443号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这6个SNPs 位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具 有SEQIDNO: l和2、 3和4、 5和6、 7和8、 9和10所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成 技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这六对引物。本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号和 rsl801131号SNP位点、甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rsl801394号SNP位点、维生素D受体基因上rs731236 号和rsl544410号、G蛋白P 3亚单位基因上rs5443号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性 检测出这六个SNPs位点基因型的T叫nrnn探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选 地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 11和12、 13和14、 15和16、 17和18、 19和20所示序列的Taqman 探针对。特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特 异性荧光Taqman探针对不限于这六对探针，所有可用于荧光定量PCR法检测本发明中所述的六个SNPs位 点的探针均在本发明范围内。本发明试剂盒的组分和含量包括6ul 10 X荧光定量PCR反应缓沖液，0. 6u1 25mM dNTP混合液，3.6ul 25mM MgCl2溶液，0. 15ul (5units/ul) Taq DNA聚合酶，20uM特异性引物对每条引物各0.225ul，IO一特异性荧光探针对每条探针各0.25nl， 去离子水31.95nl。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂两所建议的条件。实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应使用评估孕前营养代谢遗传能力的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和荧光探针对:有义引物l: 5 反义引物l: 5 5 5 5 5 5 5有义引物2 反义引物2 有义引物3 反义引物3 有义引物4 反义引物4 有义引物5: 5 反义引物5: 5 有义引物6: 5 反义引物6: 5 带VIC荧光基团探针l 带FAM荧光基团探针1 带VIC荧光基团探针2 带FAM荧光基团探针2 带VIC荧光基团探针3 带FAM荧光基团探针3 带VIC荧光基团探针4 带FAM荧光基团探针4 带VIC荧光基团探针5 带FAM荧光基团探针5MAGCTGCGTGA -3' (SEQ ID NO: 1) TGAAGGAGAAGGTG -3' (SEQ ID NO: 2) MGAACGMGACTTCA -3' (SEQ ID NO: 3) GGGAGGAGCTGAC -3' (SEQ ID NO: 4) GCCATCGCAGAA -3' (SEQ ID NO: 5) ATCCATGTACCACAG -3' (SEQ ID NO: 6) TGGACAGGCGGTCC -3' (SEQ ID NO: 7) CTGGGGTGCAGGAC -3' (SEQ ID NO: 8) GAGCAGAGCCTGAGTATT -3' (SEQ ID NO: 9) TTCCT謀CCACAGA -3' (SEQ ID NO: 10) AGAGCATCATCTGCGGCAT -3' (SEQ ID NO: 11) GGCGGCCACTGAGGG -3' (SEQ ID NO: 12)5' - ATCGgCTCCC -3'5， - TCGaCTCCCGC -3'5' - ACACTTgCTTC -3'5' - CACTTtCTTCA -3'5' - MTaTGTGAGCAAG5, - AATgTGTGAGCAA -3'5' - TGGCCTCgATCAG -3'5' - TGGCCTCaATCAG -3'5， - GGGMTGtGCAGGC -3'5' - GGMTGcGCAGGC -3'5， - ACGTCcGTGGCC -3' 5，(SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 16) 3' (SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 20) (SEQ ID NO: 21) (SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO: 23)带VIC荧光基团探针6:带FAM荧光基团探针6: 5' - ACGTCtGTGGCCT _3' (SEQ ID NO: 24) 有义引物l,反义引物l、带VIC荧光基团探针1、带FAM荧光基团探针1特异地针对检测5,10-亚甲 基四氨叶酸还原酶基因上rsl80U33号SNP位点多态性；有义引物2，反义引物2、带VIC荧光基团探针2、带FAM荧光基团探针2特异地针对检测5,10-亚甲 基四氢叶酸还原酶基因上rsl801131SNP位点多态性；有义引物3，反义引物3、带VIC荧光基团探针3、带FAM荧光基团探针3特异地针对检测甲硫氨酸合 成酶还原酶基因上rsl801394号SNP位点多态性；有义引物4，反义引物4、带VIC荧光基团探针4、带FAM荧光基团探针4特异地针对检测维生素D受 体基因上rs731236号SNP位点多态性；有义引物5，反义引物5、带VIC荧光基团探针5、带FAM荧光基团探针5特异地针对检测维生素D受体基因上rsl544410号SNP位点多态性；有义引物6，反义引物6、带VIC荧光基团探针6、带FAM荧光基团探针6特异地针对检测G蛋白e3 亚单位基因上rs5443号SNP位点多态性；6个SNPs位点分别进行6次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积10pl，包含浓度为 20ng/nl的DNA模板2pl、 lpl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0. lpl 25mM dNTP混.合液、0. 6^1 25mM MgCl2 溶液、0.025pl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20^M的有义引物和反义引物各0. 225pl、 10一的带VIC 荧光探针和带FAM荧光探针各0. 25^1,去离子水5. 325jd。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50'C、 2分钟，95'C、 IO分钟，进行60个循环的 95'C、 30秒，60C、 l分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。歩骤3: SNP基因型分析熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。实施例2.评估孕前营养代谢遗传能力的服务 步骤l: DNA提取由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。步骤2:基因分型检测使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133 号和rsl801131号SNP位点、甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rsl801394号SNP位点、维生素D受体基因上 rs731236号和rsl544410号、G蛋白P 3亚单位基因上rs5443号SNP位点分别进行荧光定量PCR检测，确 定这6个SNPs位点的基因型。步骤3:孕前营养代谢遗传能力的分析通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具孕前营养代谢遗传能力的分析报告单。报告中详细说明了 被检测者孕前各种营养代谢遗传能力的高低，并由医师向被检者详细说明和解读孕前营养代谢遗传能力评 估分析报告单。序列表<110>上海主健生物工程有限公司<120〉 一种评估孕前营养代谢遗传能力的试剂盒<勝24<210〉 1 <211〉 12 <212> DM <213>人工序列<220〉<223〉引物 <400> 1AAAGCTGCGT GA 12<210> 2 <211> 14 <212〉 DNA <213>人工序列<220〉<223>引物 <400> 2TGAAGGAGAA GGTG 14<210> 3<211〉 16 <212〉腿 <213〉人工序列<220〉<223>引物 <400> 3AAGAACGAAG ACTTCA 16<210> 4<211> 13 <212>瞧 <213>人工序列<220〉<223>引物 <400> 4GGGAGGAGCT GAC 13<210> <211> <212> <213>512DNA人工序列<220><223>引物 <400> 5GCCATCGCAG AA 12<210> <211> <212> <213>615DNA人工序列<220><223>引物 働〉6ATCCATGTAC CACAG 15<210> <211> <212> <213>14 ■人工序列<220〉<223>引物 <400> 7TGGACAGGCG GTCC "<210> 8 〈211> 14 <212> DNA <213>人工序列<220>〈223〉引物<400〉 8CTGGGGTGCA GGAC 14<210> 〈211〉 <212〉 <213〉918DNA人工序列<220〉<223>引物 <柳> 9GAGCAGAGCC TGAGTATT 18<210〉 <211〉 <212〉 <213〉10 16 賺人工序列<220><223〉引物 < 10TTCCTGGGGC CACAGA 16<210> <211〉 <212〉 <213〉11 19 ■人工序列<220〉<223〉引物 <400〉 11AGAGCATCAT CTGCGGCAT 19<210〉 <211〉 <212〉 <213〉12 15 DNA人工序列<220><223〉引物 <■〉 12GGCGGCCACT GAGGG 15<210> 13 <211> 10 <212> DNA <213>人工序列<220><223〉探针<400> 13 ATCGgCTCCC<210〉 14 <211〉 11 <212> DNA <213〉人工序列<220><223>探针催> 14 TCGaCTCCCG C<210〉 15 <211> 11 <212〉 DNA <213>人工序列<220><223>探针< 15 ACACTTgCTT C<210> 16 <211> 11 <212> DNA <213>人工序列<220>〈223〉探针 <400〉 16CACTTtCTTC A <210> 1710111111<211> 14 <212> ■ <213>人工序列<220〉〈223 >探针 <400> 17AATaTGTGAG CAAG 14<210> 18 <211> 13 <212〉 DNA <213〉人工序列<220><223〉探针 <揚18AATgTGTGAG CAA 13<210> 19 <211> 13 <212> DNA <213>人工序列<220><223〉探针 <400> 19TGGCCTCgAT CAG 13<210> 20 <211> 13 <212> DNA <213>人工序列<220><223>探针 〈400> 20TGGCCTCaAT CAG 13<210> 21 <211> 14 <212> DNA<formula>formula see original document page 12</formula>
权利要求
1. 一种评估孕前营养代谢遗传能力试剂盒，其特征在于包括同时检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133号和rs1801131号SNP位点、甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rs1801394号SNP位点、维生素D受体基因上rs731236号和rs1544410号、G蛋白β3亚单位基因上rs5443号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对5, 10-亚甲基四氧叶酸 还原酶基因上rsl801133号和rsl801131号SNP位点、甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rsl801394号SNP位 点、维生素D受体基因上rs731236号和rsl544410号、G蛋白P 3亚单位基因上rs5443号SNP位点而设 计，肖巨特异性扩增出包含这6个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针对是指针对5,10-亚甲基四氢 叶酸还原酶基因上rsl801133号和rsl801131号SNP位点、甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rsl801394号SNP 位点、维生素D受体基因上rs731236号和rsl544410号、G蛋白P 3亚单位基因上rs5443号SNP位点而 设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这6个SNPs位点基因型的Tacpan探针对。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQIDNO: l和2、 3 和4、 5和6、 7和8、 9和10、 11和12所示序列的引物对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQ IDNO: 13和 14、 15和16、 17和18、 19和20、 21和22、 23和24所示序列的Taqman探针对。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括6pl IOX荧光定量PCR反 应缓冲液、0.6nl 25raM dNTP混合液、3^1 25mM MgClz溶液、0. 15fU (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20-特异性引物对每条引物各0.225^1、 10nM特异性荧光探针对每条探针各0.25nl、去离子水31.95jil。本试 剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
全文摘要
本发明公开了一种评估孕前营养代谢遗传能力的试剂盒。该试剂盒包括同时检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133号和rs1801131号SNP位点、甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rs1801394号SNP位点、维生素D受体基因上rs731236号和rs1544410号、G蛋白β3亚单位基因上rs5443号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与孕前营养代谢遗传能力密切相关的单核苷酸多态性位点基因型来评估孕前营养代谢遗传能力。
文档编号C12N15/11GK101240324SQ20071003717
公开日2008年8月13日 申请日期2007年2月6日 优先权日2007年2月6日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司