专利名称：：一种重要发热病原快速筛查系统的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种蛋白悬浮芯片及其制备方法与应用，尤其涉及同时检测几种引起发热的感染性病原抗体的检测如结核抗体、流感抗体、禽流感抗体、鼠疫抗体、SARS抗体等的蛋白悬浮芯片及其制备方法与应用，属于免疫技术及临床检测技术领咸
背景技术：
：2003年全球SARS流行、亚洲各国频频爆发的禽流感、登革热、中缅边境的恶性痗疾、此起彼伏的脑炎、流感、又进入活3夭期的鼠疫、美国的西尼罗热、非洲的埃博拉出血热等，引起民众对传染病的广泛恐惧。世界卫生组织2002年关于传染病的分析报告中指出，全世界每小时有1500人死于传染病。而发热是传染病最常见最为突出的临床症状之一。目前已知能引M热的物质有许多种，但与发热最相关的是生物源的，如结核分枝杆菌、流感病毒、禽流感病、鼠疫菌、SARS、毒炭疽杆菌、登革病毒、西尼罗病毒、肺炎衣原体、支原体感染等。由于每一个感染者都是一个快速流动、难以控制的传染源，实施快速检测，及时、快速鉴别病原是传染病防控早发现、早预警、早处置的基础和前提。目前病原的快速检测技术发展很快，针对不同的生物标识物分别发展了不同的快速检测方法。如检测核酸的各类PCR、原位杂交、DNA芯片、NASBA等技术，检测蛋白质等抗原、抗体物质的ELISA、免疫层析技术、蛋白芯片技术等，都具有各自的特点。针对病原核酸的PCR等快速检测技术需依赖仪器的基因扩增和电泳过程，也依赖操作人员的技术水平，难以满足口岸现场简便快速筛查需要。一般的方法主要检测单种病原或传染病，面对一个发热患者，难以实现多病因的同时筛查。快速筛查是早期识别传染病的关键，传染病的快速检测技术水平不仅关系人民的生命健康，也关系着中国的检疫水平在国际上的可信程度和声譽影响着我国对外的人员交流活动和国家的国际形象，也影响着能否控制传染病的传入传出避免外事纠纷。因此，快速检测技术的提高是传染病防控工作非常重要的环节，加强快速检测技术应用基础研究刻不容统具有非常重要的意义既是提高我国卫生检疫防疫整体工作水平和质量的需要又维护我国公共卫生安全的需要。悬浮芯片(suspensionarray)^称'液相芯片(liquidarray,liquidchip),是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为冲企测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗樣"求大小约5.5nm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通逸每次仅允许一个微球通过检测通道，检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的纟效球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。与以往的技术相比，当今发展的生物芯片技术可以实现把几种发热病原一次性联合检测的目的，目前产生的悬浮芯片技术还是生物芯片的一种，它除了可以检测多种病原以外，还具有比ELISA反应更加充分的液相环境，且具有省时省力，特异性强，灵敏度高，并且无创伤的优点。因此研制和开发一种重要发热病原快速筛查系统对我国出入境人员的快速检测其有无携带传染病原的监测有重要的研究意义
发明内容本发明的目的在于为人们提供一种重要感染病原快速筛查系统的蛋白悬浮芯片检测方法，实现能在短时间内同时检测几种？1M热的病原抗体，从而得出被检测人员有没被相应病原感染，有无疫情的发生，为出入境人员能够快速通过出有无携带外来传染病原的出入境体检的需要节约了时间，又能有效保障我国公共卫生安全。本发明涉及一种重要发热病原快速筛查系统的蛋白悬浮芯片检测方法针对一种或多种引M热的感染性病原制备出相应诊断抗原，分别与不同编号的微球偶联，制备出可对上述病原抗体检测的蛋白悬浮芯片，在应用时，加入待检血清，使血清中的抗体被微球上的抗原捕恭再与生物素标记的二抗(生物素化羊抗人IgG)共同孵育，然后与链霉亲和素-藻红蛋白反应，通过Bio-PlexSystem检测系统，实现对上述病原抗体一次性;险测。下面对本发明所述的重要发热病原快速筛查系统的蛋白悬浮芯片检测方法进行详细的描述本发明的重要发热病原包括，例如结核分枝杆菌、流感病毒、禽流感病毒、鼠疫杆菌、SARS病毒。本发明确定了用于捕获相应抗体的抗原分别使结核分枝杆菌的38KD蛋白、16KD蛋白、LAM抗原，流感NP蛋白、禽流感H5抗原、鼠疫菌Fl抗原、SARS-CoVN蛋白；所要捕获的抗体分别是兔抗TBIgG、结核抗体、鼠抗流感NPIgG、兔抗H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARSIgG;相应的生物素化抗体分别是Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗鼠IgG、Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗人IgG、Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗兔IgG,检测人血清是所用生物素化抗体为Biotin羊抗人的二抗。本发明涉及一种快速筛查重要引起发热感染性病原的蛋白悬浮芯片，主要由微球，包被抗原，捕获抗体，生物素化抗体，链霉亲和素-藻红蛋白组成，其特征是，所述微球是27,31，32，33，43，44号羧基微球；所述包被抗原是结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白、流感NP蛋白、LAM抗原、禽流感H5抗原、鼠疫菌Fl抗原、SARS-CoV6N蛋白；所述捕获抗体是兔抗TBIgG、鼠抗流感NPIgG、结核抗体兔抗H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARSIgG;所述生物素化抗体是Biotin(即生物素)羊抗兔IgG、Biotin羊抗鼠IgG、Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗人IgG、Biotin羊抗兔IgG、Biotin羊抗兔IgG;所述包被抗原均与对应的抗体特异性的结合，所述捕获抗体均与对相应生物素化二抗(即生物素化羊抗兔IgG、生物素化羊羊抗鼠IgG、生物素化羊抗兔IgG、生物素化羊抗人IgG、生物素化羊抗兔IgG、)特异性结合；其中结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白与27号羧基微球形成偶联体，流感NP蛋白与31号羧基微球形成偶联体，LAM抗原与33号羧基微球形成偶联体，禽流感H5抗原与32号M微球形成偶联体，鼠疫菌Fl抗原与43号羧基微球形成偶联体，SARS-CoVN蛋白与44号羧基微球形成偶联体，以红色激光激发其微球基质上的红色分类荧光依据其微球基质的色彩不同确定类型；所述生物素化抗体于链霉亲和素-藻红蛋白结合，以绿色激光激发藻红蛋白，测定微球基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定微球基质上结合的捕获抗体。在上述的重要发热病原快速筛查系统的蛋白悬浮芯片中，所述捕获抗体是兔抗TBIgG、鼠抗流感NPIgG、结核抗体兔抗H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARSIgG;所述生物素化抗体是生物素化(Biotin)羊抗兔IgG、生物素化(Biotin)羊抗鼠IgG、生物素化(Biotin)羊抗兔IgG、生物素化(Biotin)羊抗人IgG、生物素化(Biotin)羊抗兔IgG、生物素化(Biotin)羊抗兔IgG;所述适用于人血清的检测项目分别是结核抗体、流感抗体、禽流感抗体、鼠疫抗体、SARS抗体。本发明所述重要发热病原快速筛查系统蛋白悬浮芯片的制备方法，其步骤是(1)活化编码微球分取27,31，32，33，43,44号编码微球到离心管中，10000g14000g离心后小心吸出上清并弃去。加入孩t球洗涤緩沖液悬浮，震荡30秒，超声30秒，10000g14000g离心，小心吸出上清并弃去。加入微球活化緩冲液，接着先加入新鲜配置的EDC，紧接着加入新鲜配置的Sulfo-NHS，高速震荡后用铝箔包裹，在室温震摇20min40min。加入PBS，震荡后，10000g14000g离心，小心吸出上清并弃去(重复此步骤一次)。加入的PBS悬浮编码微球，中速震荡后，超声。(2)抗原包被编码微球M目应的抗原加入到活化后的编码微球中，用PBS(pH7.4)定溶至500pL，铝箔包裹在室温震摇30min-2h。10000g~14000g离心后，小心吸出上清，弃去。用500(oL的PBS(pH7.4)洗一次，10000g~14000g离心后，小心吸出上清，弃去。加入封闭緩沖液悬浮编码微球，中速震荡，用铝箔包裹，在室温震摇10min60min,lOOOOg-14000g离心后，小心吸出上清，弃去。加入储备緩沖液洗涤编码微球，10000g~16000g离心后，小心吸出上清，弃去。最后用储备緩沖液悬浮编码微球，于4。C避光保存备用。(3)包被微球的计数吸取适量微球，稀释后，用血球计数板在普通显微镜下计数，计算微球数量。本发明所述重要发热病原快速筛查系统的蛋白悬浮芯片方法，其所述样品的悬浮芯片检测具体步骤如下采用间接法的免疫学检测模式，检测过程中全部反应均在96孔滤板上进行。(1)每孔加入4企测緩沖液预湿孔，用真空泵抽滤；(2)每孔加入含相应编码孩U求的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵抽滤两次；(3)加入稀释的检测样品，混匀后室温避光震摇30min，洗液洗涤并抽滤三)夂；(4)加入适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化二抗混匀后室温避光震摇30min60min，洗液洗涤3-6次，并真空泵抽滤；(5)加入SA-PE，混匀后室温避光震摇10~30min,洗液洗涤3-6次，并真空泵抽滤；(6)加入检测緩沖液，经振荡使小球重悬均匀；(7)用Bio-Plex悬浮芯片系统读耳又FMI数值并分析数据。本发明的方法不但可以快速筛查多种病原的抗体而且，由于多个包被病原菌的抗原的微球在同一体系中，不同的抗原可以和不同的目的分子结合，反应后通过激光检测微球基质的色彩编号可以对不同的检测反应加以区分，因而更加省时省力，同时节约了4企测的成本。图1、本发明的多重体系微^M企测兔抗TB的标准曲线；图2、本发明的多重体系微^M企测鼠抗流感NP的标准曲线；图3、本发明的多重体系微球检测鼠抗禽流感H5N1的标准曲线，灵敏度为69.4ng/ml;图4、本发明的多重体系微珎验测兔抗鼠疫F1的标准曲线，灵壽丈度为6.29475ng/ml;图5、本发明的多重体系微球检测兔抗SarsN13的标准曲线，灵敏度为15.5265ng/ml。上述附图为抗体浓度一一编码微球表面的焚光强度剂量反应曲线。编码微球表面焚光强度与加入的抗体量在一定的范围内成正相羌其中横坐标为多重微球体系中加入的抗体的量，纵坐标代表相应编码《效球表面的焚光强度。可以通过拟合的标准曲线实现对检测抗体的半定量分析。AE分别为兔抗TBIgG、鼠抗流感NPIgG、结核抗体兔抗H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、兔抗SARSIgG荧光强度剂量反应曲线。具体实施例方式实施例l:包被抗原与已知编号微球的偶联1.分别取27，31,32,33,43，44号编码微球，用凝涡振荡器振荡微球悬液，时间30s，超声30秒，使微球混合均匀；2.分别取上述各编码微球1.25x106个到1.5mL离心管中，10000g~14000g离心4min，小心吸出上清并弃去；3.加入100joL的珠球洗涤緩冲液(PBS，pH7.4,0.05%TWEEN-20)9悬浮微球，震荡30秒，超声30秒，lOOOOg—14000g离心4min,小心吸出上清并弃去；4.加入80jiL的珠球活化緩冲液(3gNaH2P04，5NNaOH40drops/250mLH20)，用旋涡振荡器振荡微球悬氣5.加入10pL新鲜配置的EDC(50mg/mL)，紧接着加入10|aL新鲜配置的Sulfo-NHS(50mg/mL)，高速震荡30秒后用铝箔包裹，在室温震摇20min;6.加入150^L的PBS(pH7.4)，震荡10秒后，10000g-14000g离心4min,小心吸出上清并弃去；7.重复上步骤一次；8.加入100^iL的PBS(pH7.4)悬浮编码」微球，中速震荡30秒后，超声15秒；9.分别取抗原结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白、流感NP蛋白、LAM抗原、禽流感H5抗原、鼠疫菌F1抗原、SARS-CoVN蛋白l-10吗加入到活化后的编码微球中，用PBS(pH7.4)定溶至500^L;10.铝箔包裹在室温震摇2h，lOOOOg-14000g离心4min，小心吸出上清，弃去；11.用500jiL的PBS(pH7.4)洗一次，10000g~14000g离心4min,小心吸出上清，弃去；12.加入250jjL的封闭緩沖液(PBS(pH7.4),1%BSA,0.05%Azide)悬浮编码微球，中速震荡15秒，用铝箔包裹，在室温震摇30min，10000g~14000g离心4min，小心吸出上清，弃去；13.加入500|iiL的储备緩冲液(PBS(pH7.4),0.1%BSA，0.02%TWEEN，0.05%叠氮化物)洗涤编码微球，lOOOOg-16000g离心6min,小心吸出上清，弃去；14.最后用1501iL的储备緩冲液悬浮编码微球，即得结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白与27号J^微球形成偶联体，流感NP蛋白与31号羧基微球形成偶联体，LAM抗原与33号羧基微球形成偶联体，禽流感H5抗原与32号羧基微球形成偶联体，鼠疫菌Fl抗原与43号羧基微球形成偶联体，SARS-CoVN蛋白与44号羧基微球形成偶联体；15.吸取适量微球，稀释后，用血球计数板在荧光显微镜下计数，换算出每种微球的浓度；16.把偶联号得微球放在4'C避光保存，一般每种抗原偶联体的微球单独保存，使用时，依据检测项目选择混合。实施例2:样品的悬浮芯片检测采用间接法的免疫学检测模式检测过程中全部反应均在96孔滤板上进行。1.每孔加入150(iL检测緩冲液预湿孔，用真空泵抽滤；2.每孔加入50jiL含相应编码孩t球的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵抽滤两次；3.加入50(iL稀释的检测样品，混勻后室温避光震摇30min,洗液洗涤并抽滤三次；4.加入50(iL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化二4^混勻后室温避光震摇30min，洗液100pL洗涤3次，并真空泵抽滤；5.加入50(iL的SA-PE,混匀后室温避光震摇10min。洗液100|aL洗涤3次，并真空泵抽滤；6.加入125jiL的检测緩沖泉经振荡使小球重悬均匀；7.用Bio-Plex悬浮芯片系统读取FMI数值并分析数据。实施例3:多重微球体系对不同浓度兔抗TBIgG的检测1.各抗原与不同编码微球偶联，具体操作方法如实施例1,得到不同抗原与编码微:昧的偶联体；2.取包被有抗原结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27号羧基微球偶联体，禽流感H5抗原的32号羧基微球偶联体，鼠疫菌F1抗原的43号羧基微球偶联体,SARS-CoVN蛋白的44号羧基微球偶联体，各3500个，加入同一离心管中，加微球稀释液至总体积50pL作为多重微球体系的检测工作溶液；3.将兔抗TBIgG用样品稀释液做4倍梯度稀释作为检测的样品，兔抗TBIgG的浓度分别是0.147ng/ml、0.588ng/ml、2.354ng/ml、9.418ng/ml、37.672ng/ml、150.687ng/ml、602.75ng/ml、2.411jig/ml;4.具体的检测操作步骤如实施例2;5.各微球检测兔抗TB的得到的MFI值见下表1,多重体系微球检测兔抗TB的标准曲线FI=2.32671+(5582.99-2.32671)/((l+(Conc/331.934)A-1.42723))A0.78545检测灵敏度为1.5815ng/ml。表1多重体系微^^r测兔抗TB的MFI值兔抗TBIgGMFI值浓度(ng/ml)N13(44)TB(27)FlAg(43)H5(32)048.75127.584.30.1476514.5101100.5885620101032.3545538.591079.41858107810737.672635119105150.6878118468,5103602.75118.542338992411.321535511117实施例4:多重W体系对不同浓度鼠抗流感NP抗体的检测1.各抗原与不同编码微球偶联，具体操作方法如实施例1;得到不同抗原与编码微球的偶联体；2.取包被有抗原结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27号羧基微球偶联体，流感NP蛋白的31号羧基微球偶联体，鼠疫菌Fl抗原的43号羧基微球偶联体，SARS-CoVN蛋白的44号羧基微球偶联体，12各3500个，加入同一离心管中，加微球稀释液至总体积50(xL作为多重微球体系的检测工作溶液；3.将鼠抗流感NP抗体用样品稀释液做4倍梯度稀释作为检测的样品，鼠抗流感NP抗体的浓度分别是3.052ng/ml、12.207ng/ml、48.828ng/ml、195.312ng/ml、781.25ng/ml、3125ng/ml、12500ng/ml、50000ng/ml;4.具体的检测操作步骤如实施例2;5.各微球4企测鼠抗流感NP抗体得到的MFI值见下表2,多重体系微J^险测鼠抗禽流感NP的标准曲线FI-20.3844+(583.981-20.3844)/((1+(Conc/6113.06)A-2.38124))A0.349701灵敏度为968.8ng/ml。表2多重体系微^M^r测鼠抗禽流感NP的MFI值鼠抗流感MFI值<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例5:多重微球体系对不同浓度鼠抗禽流感H5N1抗体的检测1.各抗原与不同编码微球偶联，具体操作方法如实施例1;得到不同抗原与编码微球的偶联体；2.取包被有抗原结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27号羧基微球偶联体，禽流感H5抗原的32号羧基微球偶联体，鼠疫菌Fl抗原的43号羧基微球偶联体，SARS-CoVN蛋白的44号羧基微球偶联体，各3500个，加入同一离心管中，加微球稀释液至总体积50nL作为多重微球体系的检测工作溶液；3.将鼠抗禽流感H5N1抗体用样品稀释液做4倍梯度稀释作为检测的样品，鼠抗禽流感H5N1抗体的浓度分别是0.305ng/ml、1.2nng/ml、4.883ng/ml、19.531ng/ml、78.125ng/ml、312.5ng/ml、1250.Ong/ml、5000.Ong/ml、20000ng/ml;4.具体的检测操作步骤如实施例2;5.各微^J险测检测鼠抗禽流感H5N1抗体的MFI值见下表3，多重体系微Jl^r测鼠抗禽流感H5Nl的标准曲线FI=11.2281+(1516.12-11.2281)/((1+(Conc/628.306)A—1.0296))A1.06526灵敏度为69.4ng/ml。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例6:多重微球体系对不同浓度兔抗鼠疫F1抗体的检测1.各抗原与不同编码微球偶联，具体操作方法如实施例1;得到不同抗原与编码微球的偶联体；2.取包被有抗原结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27号羧基微球偶联体，禽流感H5抗原的32号羧基微球偶联体，鼠疫菌Fl抗原的43号羧基微球偶联体，SARS-CoVN蛋白的44号羧基樣t球偶联体，各3500个，加入同一离心管中，加微球稀释液至总体积50/aL作为多重微J求体系的4全测工作溶液；3.将兔抗鼠疫F1抗体的用样品稀释液做4倍梯度稀释作为检测的样品，兔抗鼠疫Fl抗体的浓度分别是0.305ng/ml、1.221ng/ml、4.883ng/ml、19.531ng/ml、78.125ng/ml、312.5ng/ml、1250.Ong/ml、5000.Ong/ml、20000.Ong/ml、80000.Ong/ml;4.具体的检测才喿作步骤如实施例2;5.各微球检测检测兔抗鼠疫F1抗体的MFI值见下表4，多重体系微球检测兔抗鼠疫F1抗体浓度的标准曲线FI=4.423+(4130.55-4.423)〃1+(Conc/1853.93)八-0.986615)灵敏度为6.29475ng/ml。表4多重体系微^M企测兔抗鼠疫Fl抗体的MFI值<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>6420000.015.510338356180000.018984137.570实施例7:多重微球体系对不同浓度兔抗SarsN13抗体的检测1.各抗原与不同编码微球偶联，具体操作方法如实施例1;得到不同抗原与编码微球的偶联体；2.取包被有抗原结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27号羧基微球偶联体，禽流感H5抗原的32号羧基微球偶联体，鼠疫菌Fl抗原的43号^4微球偶联体，SARS-CoVN蛋白的44号羧基微球偶联体，各3500个，加入同一离心管中，加微球稀释液至总体积50|uL作为多重微球体系的检测工作溶氣3.将兔抗SarsN13抗体的用样品稀释液做4倍梯度稀释作为检测的样品，兔抗SarsN13抗体的浓度分别是0.034ng/ml、0.137ng/ml、0.549ng/ml、2.197ng/ml、8.789ng/ml、35.156ng/ml、140.625ng/ml、562.5ng/ml、2250.0ng/ml;4.具体的检测操作步骤如实施例2;5.各微^M企测检测兔抗SarsN13抗体的MFI值见下表5，多重体系微球4企测兔抗SarsNl3抗体浓度的标准曲线FI=8.9686+(2204.42—8.9686)/((1+(Conc/287.286)A-1.2352))Al.10117灵敏度为15.5265ng/ml。表5多重体系微球检测兔抗SarsN13的MFI值兔抗SarsN13MFI值抗体浓度(ng/ml)TB(27)H5(32)FlAg(43)N13(44)012.884.2512.25450.0341388.51350.50.137161001455160.5491811317562.19716110.513.5598.78915941472.535.156138012169140.625169614627562.518821215182250.02967112079.5实施例8:本发明所述重要发热病原快速筛查系统的蛋白,辩芯片在检测人血清中结核抗体的应用。1.取结核LAM抗原与33号编码微球偶联，具体操作方法如实施例1;得到LAM抗原与33号编码微球的偶联体；2.将被诊断为结核病人的35份血清和53份正常健康人血清分别用样品稀释液估支l:io倍梯稀释；3.取96孔滤板，在每孔加入150iiiL检测緩沖液预湿孔，用真空泵抽滤；4.每孔加入50jaL含3500个包被有LAM抗原的33号编码微球的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵抽滤两次；5.加入50jliL稀释的检测样品，混匀后室温避光震摇30min，洗液洗涤并抽滤三次；6.加入50(iL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化羊抗人IgG,混匀后室温避光震摇30min，洗液100|iL洗涤3次，并真空泵抽滤；7.加入50pL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10min。洗液100jaL洗涤3次，并真空泵抽滤；8.加入125jiL的检测緩沖液,经振荡使小球重悬均匀；9.用Bio-Plex悬浮芯片系统进行检测；10.同样的血清样本用于市售ELISA试剂盒;f企测。检测结果见表6、7，由此可见由lam抗原检测的结核抗体的检测灵敏度为68.57%、特异度为83.02%、准确度为77.27%;ELISA试剂盒^r17测血清中结核抗体的检测灵敏度为62.86%、特异度为94.34%、准确度为81.82%,lam抗原包被的微球用悬浮芯片检测结核抗体的灵敏度比市售ELISA法的灵敏度高，检测率也较高。表6lam抗原检测人样本中结核抗体的检测结果血清类型例数阳性阴性阳性检出率结核病人35241168.57%正常人5394416.98%合计88335537.50%表7EILSA试剂盒检测人血清中结核抗体的检测结果血清类型例数阳性阴性阳性检出率结核病人35221362.86%正常人533505.66%合计88256328.41%实施例9:本发明所述重要发热病原快速筛查系统的蛋白悬浮芯片在检测人血清中结核抗体、禽流感抗体、鼠疫抗体、SARS抗体的应用。1.各抗原与不同编码微球偶联，具体操作方法如实施例1;得到不同抗原与编码微5求的偶联体；2.取包被有抗原结核分枝杆菌的38KD蛋白和16KD蛋白的27号羧基微球偶联体，禽流感H5抗原的32号羧基微球偶联体，鼠疫菌Fl抗原的43号M^微球偶联体，SARS-CoVN蛋白的44号氣基微球偶联体，各3500个，加入同一离心管中，加孩O求稀释液至总体积50iuL作为多重微球体系的检测工作溶泉3.将94份人血清分别用样品稀释液做1:1G倍梯稀释；4.取96孔滤板，在每孔加入150jiL检测緩沖液预湿孔，用真空泵抽滤；5.每孔加入50uL上述步骤2中的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵抽滤两次；6.加入50mL稀释的检测样品，混匀后室温避光震摇30min，洗液18洗涤并抽滤三次；7.加入50iaL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化羊抗人IgG,混匀后室温避光震摇30min,洗液100nL洗涤3次，并真空泵抽滤；8.加入50jaL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10min。洗液100jaL洗涤3次，并真空泵抽滤；9.加入125juL的检测緩冲液，经振荡使小球重悬均匀；10.用Bio-Plex悬浮芯片系统进行4企测。结果判定单个检测项目中94个人检测荧光值MFI的平均值与3倍的94个Ai企测焚光值MFI的标准差的和作为该;险测项目的cutoff值，如果检测的MFI值>cutoff值为阳性，反之为阴性。检测结果见下表8。表8多重微球体系4企测人血清结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>权利要求1.一种重要发热病原快速筛查系统的蛋白悬浮芯片，其特征是，由编码微球，包被抗原，检测抗体，生物素化抗体，链霉亲和素-藻红蛋白组成。2.如权利要求l所述的蛋白悬浮芯片，其特征是，所述包被抗原选自下列的一种或多种结核16KD和38KD蛋白，流感NP蛋白，禽流感H5抗原，结核LAM抗原，鼠疫菌F1抗原，SARS-CoVN蛋白。3.如权利要求l所述的蛋白悬浮芯片，其特征是，所述检测抗体选自兔抗TBIgG，鼠抗流感NPIgG，兔抗H5N1血清，结核抗体，兔抗鼠疫IgG，兔抗SARSIgG中的一种或多种。4.如权利要求l所述的蛋白悬浮芯片，其特征是，所述生物素化抗体选自Biotin羊抗兔IgG,Biotin羊抗鼠IgG，Biotin羊抗兔IgG，Biotin羊抗人IgG,Biotin羊抗兔IgG,Biotin羊抗兔IgG中的一种或多种。5.如权利要求l所述的蛋白悬浮芯片，其特征是，可以检测结核抗体，流感抗体，禽流感抗体，鼠疫抗体，SARS抗体中的一种或多种。6.—种采用蛋白悬浮芯片快速筛查重要发热病原抗体的检测方法，其特征是针对一种或多种重要发热病原制备出相应抗原，分别与不同编号的微球偶联，制备出可对上述病原抗体检测的蛋白悬浮芯片，在应用时，加入待检血清，使血清中的抗体被微球上的抗原捕获，再与生物素标记的二抗(即生物素化羊抗人IgG)共同孵育，然后与链霉亲和素-藻红蛋白反应，通过Bio-PlexSystem检测系统，实现对上述病原抗体一次性检测。7.如权利要求6所述的蛋白悬浮芯片检测方法，其特征是选取27，31,,33，43,44号羧基微球作为编码微球，洗涤；活化g微球；分别对应27,31，32，33，43，44号羧基微球顺序加入结核16KD和38KD蛋白，流感NP蛋白，禽流感H5抗原，结核LAM抗原，鼠疫菌F1抗原，SARS-CoVN蛋白抗原；混匀；在室温下。以300-900rpm的转速放在摇床上孵育30120分钟；用封闭緩冲液封闭；用储备緩冲液洗涤；得结核16KD和38KD蛋白与27号微球得偶联体，流感NP蛋白与31号微球得偶联体，禽流感H5抗与32号微球得偶联体，结核LAM抗原与33号微球得偶联体，鼠疫菌F1抗原与43号微球得偶联体，SARS-CoVN蛋白抗原与44号微球得偶联体；计数每种微球偶联体的单位体积数，确定浓度，分别于4。C条件下避光保存；使用时，依据检测项目选择混合。8.如权利要求l-5任一项所述的重要发热病原快速筛查系统的蛋白悬浮芯片检测在检测人血清样本中的应用。全文摘要本发明公开了一种用于重要发热病原快速筛查系统的检测方法，主要涉及检测血清中结核抗体、流感抗体、禽流感抗体、鼠疫抗体、SARS抗体。芯片主要由编码微球，包被抗原，检测抗体，生物素化抗体，链霉亲和素-藻红蛋白组成，该方法包括包被抗原与编码微球的偶联，检测抗体将分别特异性的与相应的各号微球偶联，以红色激光激发其球形基质上的分类荧光，依据其球形基质色彩不同确定类型；其中的生物素化抗体将与检测抗体结合；所述的链霉亲和素-藻红蛋白与微球上捕获检测抗体的生物素结合，以绿色激光激发藻红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的检测抗体的含量，从而来确定是否被病原感染，达到快速筛查发热病原的目的。文档编号G01N33/546GK101504414SQ20091008025公开日2009年8月12日申请日期2009年3月17日优先权日2009年3月17日发明者孙肖红,宇杨,杨永莉,静王,胡孔新申请人:中国检验检疫科学研究院