专利名称：叶酸代谢能力遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及遗传学，分子生物学，临床医学及预防医学技术领域，具体地涉及ー种叶酸代谢能力遗传检测试剂盒，是通过联合检测三个核酸(DNA和RNA)分子标记上单核苷酸多态性，来评估受检者的叶酸代谢能力，有利于个性化指导孕前、孕期叶酸补充剂量，预警子代发生神经管缺陷病的风险，预测个体高同型半胱氨酸血症的发病风险，也可评估个体患脑卒中、脑出血、脑梗塞、冠心病等心脑血管疾病的风险大小。
背景技术：
叶酸是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物，是ー种水溶性B族维生素。叶酸对人体的重要营养作用早在1948年即已得到证实，是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。叶酸在同型半胱氨酸代谢途径中发挥重要作用。叶酸在体内叶酸以四氢叶酸的形式起作用，如果叶酸缺乏，N5-甲基四氢叶酸合成不足，那么同型半胱氨酸向甲硫氨酸的转换就会发生障碍，相继引发出-系列病理变化同型半胱氨酸堆积，导致-碳单位甲基生成減少，这就直接影响50多种重要物质的合成。高浓度的同型半胱氨酸能损害血管的内皮细胞，成为重要的心脑血管致病因素。叶酸还帮助蛋白质的代谢，并与维生素B12共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红血球不可缺少的物质。人类(或其他动物)如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞減少症，还会导致身体无力、易怒、没胃ロ以及精神病症状。此外，研究还发现，叶酸对孕妇尤其重要。孕妇对叶酸的需求量比正常人高4倍。孕早期是胎儿器官系统分化，胎盘形成的关键时期，细胞生长，分裂十分旺盛。如在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可导致胎儿神经管发育缺陷。在我国发生率约为3. 8%。的神经管畸形，包括无脑儿，脊柱裂等。另外还可起早期的自然流产。到了孕中期，孕晩期，除了胎儿生长发育外，母体的血容量，乳房，胎盘的发育使得叶酸的需要量大增。叶酸不足，孕妇易发生胎盘早剥，妊娠高血压综合征，巨幼红细胞性贫血；胎儿易发生宫内发育迟缓，早产和出生低体重，而且这样的胎儿出生后的生长发育和智力发育都会受到影响。叶酸的营养缺乏问题由此而引起广泛的关注。虽然叶酸是是水溶性维生素，一般超出成人最低需要量20倍也不会引起中毒。但服用大剂量叶酸可能产生不良后果1.干扰抗惊厥药物的作用，诱发病人惊厥发作。2.月艮叶酸350mg可能影响锌的吸收，而导致锌缺乏，使胎儿发育迟缓，低出生体重儿增加。3.掩盖维生素B12缺乏的早期表现，而导致神经系统受损害。4.导致乳腺癌风险的上升。可见，孕前及孕期的叶酸补充剂量需要定量指导。神经管缺陷(NTDs) —直是我国围产期儿中高发的畸形疾病。1986年NTDs的发生率为27. 40/万，到2007年下降至7. 2/万，但在某些高发省份，如山西，陕西，甘肃等，发生率仍高达30/万，NTDs的发生是基因和环境因素的共同作用的結果。自1964年E. D. Hibbarc^PR. ff. Smhell首先发现叶酸缺乏与神经管缺陷(NTDs)有关以来，妇女妊娠期定量补充叶酸已经成为预防NTDs出生非常有效的措施之一。[0006]叶酸是同型半胱氨酸代谢反应中为必需因子，使血液中的同型半胱氨酸量保持在一个适当的水平。叶酸的不足可导致高同型半胱氨酸血症的发生。而高同型半胱氨酸血症是脑卒中、动脉粥样硬化和冠心病的独立危险因素。研究显示，10%的冠心病患者与同型半胱氨酸升高有关，轻、中度同型半胱氨酸水平升高可使心血管疾病死亡危险性增加4 6倍，血浆总Hcy水平每升高5 μ mo I/L则冠心病危险性男性増加60%，女性増加80%，相对危险性男性为I. 6，女性为I. 8，相当于总胆固醇每升高20mg/dL的危险性，因此成为冠心病的ー个独立危险因素。血浆同型半胱氨酸水平与冠状动脉病变血管的支数有一定关系，有人研究结果表明，单支、双支、多支血管病变的患者血浆Hcy水平呈逐级上升趋势。并且与血管病变的严重程度有关，研究表明，冠状动脉狭窄> 99%的患者血浆Hcy水平明显高于狭窄< 75%的患者。血浆同型半胱氨酸水平还与冠心病患者的远期预后、生存率、病死率有夫。我国是脑卒中高发大国，卫生部统计显示，毎年新发病200万人。脑卒中每年导致死亡150万人，是位居肿瘤之后的城乡居民第二位死因。存活的患者中，约四分之三不同程度丧失劳动能力，重度致残者占40%。全国毎年用于该病的治疗费用100亿元以上，国家和家庭的经济负担沉重。国内专家认为，我国没有推行叶酸強化食品，大众没有自觉从食物中补充叶酸的习惯，血清叶酸水平低，血浆同型半胱氨酸水平高等因素，与原发性高血压共同作用，可能是导致我国脑卒中发生率和死亡率居高不下的重要原因。对1996年至2006年国际医学界有夫“补充叶酸防治脑卒中疗效”研究的汇总分析显示，补充叶酸能使脑卒中发生风险降低18%，疗程达3年以上时，风险可下降29%。文中还引用了在中国河南省林州市进行的营养干预研究，显示补充一定数量叶酸2年后，脑卒中发生风险可降低37%。对无脑卒中既往史的人群效果更为明显。近日，由中美科学家完成的“补充叶酸预防脑卒中的疗效荟萃分析”，赢得国际权威机构“千名医学家”(FacultyoflOOOMedicine)科学文献贡献カ的高度评价，这项由中美医学家联合完成的大型汇总研究证实，补充叶酸可有效降低脑卒中风险。国际高血压联盟主席刘カ生教授认为，我国应重视和加强叶酸在防治脑卒中方面的作用。5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)位于第一号染色体1ρ36. 3位置，是參与体内叶酸代谢的关键酶，与体内叶酸/同型半胱氨酸(HCY)的代谢和蛋氨酸的合成有关，催化5，10-亚甲基四氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸盐，使之能为同型半胱氨酸提供甲基形成甲硫氨酸，并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一个较低的水平。该酶是人体叶酸代谢中的ー个重要的酶，在胚胎神经管发育(妊娠4-8周)中意义重大。MTHFR基因的缺陷可以导致多个机体必需生化途径的紊乱，包括细胞周期调控、DNA复制、DNA以及蛋白质甲基化修饰等，并进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管等多种疾病。研究发现，MTHFR 677位点的多态性是影响该酶的活性的ー个重要因素。携帯MTHFR 677 T等位基因的酶活性为野生型的45%左右，携带MTHFR 1298C等位基因的酶活性为野生型的68%左右，两种情况均阻碍了叶酸代谢，引起一系列疾病发病风险增加，而合理补充叶酸可以很大程度的防止基因缺陷引发的不良后果。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)也是參与体内叶酸代谢和同型半胱氨酸代谢的关键酶，其编码基因位于5ρ15· 3-ρ15· 2。MTRR基因rsl801394是位于5ρ15· 3_ρ15· 2之间的MTRR基因第2个外显子处的ー个A/G多态，引起MTRR基因编码的蛋白第22个氨基酸由Ile变为Met(Ile22Met)。该位点是MTRR上的主要突变，引起甲基维生素缺乏症E型，并经常用来研究与脊柱裂 、Down综合症、神经管缺陷、白血病等疾病的关系。并且研究证明，基因型为MTRR66GG、MTRR66AG的孕妇发生NTDs的危险性较正常对照组增加。在中国人群中该多态的频率分布为A占76%，G占24%左右。
发明内容我们对2573例无血缘关系的汉族妇女人群进行了 MTHFR基因C677T、A1298C以及MTRR基因A66G位点的基因检测，结果显示，MTHFR基因C677T的等位基因频率分别为63. 45%和36. 55%，]^册1 基因41298(的等位基因频率分别为78. 20%和21. 80%，MTRR基因A66G的等位基因频率分别为72. 81%和27. 19%。对基因多态性分布频率的研究发现，MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G多态性分布差异有统计学意义，因此通过三个基因多态性检测，可以指导叶酸的个性化补充和叶酸利用能力的监测，是许多疾病预防及保健的重要技术方法。本实用新型提供ー种叶酸代谢能力遗传检测试剂盒。通过对5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因上的rsl801133位点、rsl801131位点，甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因上的rsl801394位点的联合检测，评估叶酸代谢能力的大小，从而指导个性化的应用与保健，包括孕前、孕期叶酸补充剂量的指导；预警子代发生神经管缺陷病的风险；预测个体高同型半胱氨酸血症的发病风险；评估预测个体发生脑卒中、脑出血、脑梗塞、冠心病等心脑血管疾病的风险。本试剂盒的特征是由包装盒体、衬垫、衬垫孔中的装有检测三个SNP位点的PCR反应液的三个试管，装有DNA测序反应液的三个试管,装有测序产物纯化试剂的四个试管，装有PCR产物酶解组份的ー个试管，装有阴性对照品的ー个试管。本试剂盒的保存温度为-20°C,尽量减少反复冻融。本试剂盒的特征是，其主要组份和含量如下，(I)PCR反应液单个PCR反应体系包括10 XPCR缓冲液2. 5 μ l，25mM MgCl2溶液 2· 5μ l，25mMUdNTPs O. 2 μ l,25mM dNTPs 0· 2 μ 1，20 μ M 特异性引物对中的一对引物O. 5 μ I，5U/ μ I混合酶(Taq DNA聚合酶与UNG酶)I μ I。其中，使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止PCR扩增产物的污染。(2) PCR产物酶解试剂组份'2 μ I SAP酶+ExoL酶MIX。(3) DNA测序反应液有两部分组成测序反应体系和测序产物纯化。单个DNA测序反应体系包括μ I测序试剂(25% BigDye Mix)，I μ I DNA测序引物对(只使用其中一个引物)。测序产物纯化包括=IOOmM EDTA 2 μ 1，16 μ I无水こ醇，70%预冷こ醇70 μ I X 2，10 μ I去离子甲酰胺(Hi-Di Formamide)等。阴性对照品为无囷双蒸水样品。本试剂盒的特征是，三个基因多态性位点的特异性扩增引物和测序引物分别是MTHFR基因rsl801133位点特异性扩增引物对和测序引物对为扩增上游扩增引物序列5’-CAGTCCCTGTGGTCTCTTCAT-3’扩增下游扩增引物序列5’ -TCTCACCGCACCGTCCT-3’[0025]测序上游测序引物序列5’ -CGCCTTGAACAGGTGGA-3，测序下游测序引物序列5’ -TCTCACCGCACCGTCCT-3’MTHFR基因rsl801131位点特异性扩增引物对和测序引物对为扩增上游引物序列5’-GTCTCCCAACTTACCCTTCTC-3’扩增上游引物序列5’-ACGGTAGATGTAACTCTTTGGTC-3’测序下游引物序列5’-CCACTCCAGCATCACTCACT-3’测序下游测序引物序列5’-ACGGTAGATGTAACTCTTTGGTC-3’MTRR基因rsl801394位点特异性扩增引物对和测序引物对为扩增上游扩增引物序列5’-TCACTGTTACATGCCTTGAAGT-3’扩增下游扩增引物序列5’-CTTTGAAGAATTTTGGTTGGGAAGTG-3’测序上游测序引物序列5’-GGCAAAGGCCATCGCAGAAG-3’测序下游测序引物序列5’-CTTTGAAGAATTTTGGTTGGGAAGTG-3’本实用新型试剂盒通过三个叶酸代谢能力相关多态性位点的目标基因片段进行先扩增再测序的联合检測，达到对叶酸代谢能力更全面、更准确和更高效的遗传检测与评估，应用于孕前、孕期叶酸补充剂量的个体化指导；预警子代发生神经管缺陷病的风险；预测个体高同型半胱氨酸血症的风险；也是评估和预测个体发生脑卒中、脑出血、脑梗塞、冠心病等心脑血管疾病的独立风险因素。
图I为本实用新型的结构示意图。图2 为 MTHFR 基因 rsl801133 (C677T TT)位点测序图。图3 为 MTHFR 基因 rsl801131 (A1298C AA)位点测序图。图4 为 MTRR 基因 rsl801394 (A66G AG)位点测序图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进ー步阐述本实用新型。实施例仅用于说明目的，而不用干限制本发明范围。下列实施例中未做详细说明和具体描述的实验条件和实验方法，应为常规实验条件和方法，或按厂家提供的操作步骤和方法进行。实施例I參见图I，本试剂盒的特征是由包装盒体I、衬垫2、衬垫孔中装有检测SNP位点的PCR反应液的三个试管3，装有DNA测序反应液的三个试管4，装有测序产物纯化试剂的四个试管5，装有PCR产物酶解液的一个试管6，装有阴性对照品的一个试管7。本试剂盒的保存温度为_20°C，尽量减少反复冻融。本试剂盒的特征是，其主要组份和含量如下，(I) PCR反应液单个PCR反应体系包括10 XPCR缓冲液2.5 μ l，25mM MgCl2溶液 2· 5μ l，25mMUdNTPs O. 2 μ l,25mM dNTPs 0· 2 μ 1，20 μ M 特异性引物对中的一对引物O. 5 μ I，5U/ μ I混合酶(Taq DNA聚合酶与UNG酶)I μ I。其中，使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止PCR扩增产物的污染。(2) PCR 产物酶解液2 μ I SAP 酶 +ExoL 酶 MIX。[0048](3)DNA测序反应组分有两部分组成测序反应体系和测序产物纯化。单个DNA测序反应体系包括μ I测序试剂(25% BigDye Mix)，I μ I DNA测序引物对(只使用其中一个引物)。测序产物纯化包括=IOOmM EDTA 2 μ 1，16 μ I无水こ醇，70%预冷こ醇70 μ I X 2，10 μ I去离子甲酰胺(Hi-Di Formamide)等。阴性对照品为无囷双蒸水样品。实施例2本试剂盒的使用I、样本基因组DNA的获取样本用常规基因组总DNA提取与纯化方法提取口腔粘膜脱落细胞的基因组DNA，置于-20°C保存。2、采用PCR方法扩增目标DNA片段 (I)本试剂盒的特点是使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止PCR扩增产物的污染。(2)本试剂盒的PCR反应试剂组份由PCR反应液体积22 μ I、模板DNA 3 μ I (约50ng)组成。PCR 反应液包括=IOXPCR 缓冲液 2. 5 μ I, 25mM MgCl2 溶液 2. 5 μ 1，5U/ μ I 混合酶(Taq DNA 聚合酶与 UNG 酶)I μ 1，25mM UdNTPs O. 2 μ 1，25mM dNTPs 0· 2 μ I。(3)PCR反应试剂组份准备试剂开管前请完全解冻后充分混匀并短暂离心。建议在DNA提取结束后配制混合反应液，并立即加样。如特殊情況，可将下述分装好的混合反应液短期存于4°C,并在3小时内使用。(4) PCR反应试剂组份配制按每个PCR反应液体积22 μ I，模板DNA (阳性对照或阴性对照)3 μ 1，乘以所需的反应管数，计算试剂的量，加于ー个无菌离心管中，振荡混匀。再用微量加样器在每ー PCR反应管内加入25 μ I上述混匀的混合反应液。注意模板DNA若不足3 μ I可用纯水补足。(5)PCR反应条件循环I :94°C，3分钟；循环2_31 :94°C变性45秒、52°C退火45秒、72°C延伸I分钟；共30个循环；最后72°C延伸10分钟。3、PCR产物纯化(I)电泳取5 μ I扩增产物，用2. 0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，以合适的DNAMarker作为分子量大小对照，使用凝胶成像系统观察电泳結果。其余PCR产物可4°C短期保存(不超过2天，如若超过2天不使用，请置于_20°C保存)。(2)观察电泳结果(A)阴性对照应无扩增产物，否则应全部重新扩增；(B)条带清晰，且大小符合目标产物，则可用于后续测序反应；无目标条带或条带无法清晰辨认的标本，需重新进行该位点的扩增反应；重新扩增后仍无目的条带或条带无法清晰辨认的标本，建议重新进行目标DNA抽提。(3) PCR酶解产物选取PCR产物3 μ 1，再加入纯化试剂组份2 μ I SAP MIX,混匀。进行如下反应37°C 60分钟，80°C 15分钟。产物可4°C短期保存(不超过2天，如若超过2天不使用，请置于_20°C保存)。4、测序反应。将表2的各组分混合进行测序反应，测序反应试剂组份和测序反应条件见表I和表2 表IDNA测序反应试剂组份
试剂名称体积(单位μ|)
LQQ64」纯水I
权利要求1.一种叶酸代谢能力遗传检测试剂盒，其特征是由包装盒体(I)、衬垫(2)、装有检测三个SNP位点的PCR反应液的三个试管(3)、装有测定三个DNA序列的反应液的三个试管(4 )、装有纯化测序产物的试剂的四个试管(5 )、装有酶解PCR产物的试剂的一个试管(6 )、装有阴性对照品的一个试管(7 )，衬垫(2 )上设有容器孔，分别放置三管PCR反应液(3 )、三管DNA测序反应液(4 )、四管测序产物纯化试剂(5 )、酶解PCR产物的反应液(6 )和阴性对照品(7X
专利摘要本实用新型提供了一种叶酸代谢能力遗传检测试剂盒，由包装盒体1、衬垫2、衬垫孔中装有检测SNP位点的PCR反应液的三个试管3，装有DNA测序反应液的三个试管4，装有测序产物纯化试剂的四个试管5，装有PCR产物酶解液的一个试管6，装有阴性对照品的一个试管7。本实用新型试剂盒通过对三个叶酸代谢能力相关多态性位点的目标基因片段进行先扩增再测序的联合检测，达到对叶酸代谢能力更全面、更准确和更高效的遗传检测与评估，应用于孕前、孕期叶酸补充剂量的个体化指导；预警子代发生神经管缺陷病的风险；预测个体高同型半胱氨酸血症的风险；也是评估和预测个体发生脑卒中、脑出血、脑梗塞、冠心病等心脑血管疾病的独立风险因素。
文档编号C12M1/34GK202626189SQ201220200889
公开日2012年12月26日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者崔春黎, 肖自力, 纪燕燕 申请人:上海金防生物科技有限公司