专利名称：生物可利用叶酸的生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用遗传学修饰的微生物增加叶酸的总产量，且特别是生物可利用叶酸，也就是那些容易被哺乳动物胃肠道吸收的叶酸的产量。
背景技术：
叶酸(N-[4-{[(2-氨基-1，4-二氢-4-氧-蝶呤基)甲基]氨基}苯甲酰]-L-谷氨酸；维生素B11；维生素M)是一种促造血的维生素，正逐步地认识到它在人和动物的健康及伤口愈合上有着重要的作用。哺乳动物不能产生叶酸。叶酸的主要来源是植物，尤其是菠菜和其他的绿叶蔬菜，青草，酵母和其他微生物，以及间接地，动物器官(肾脏，肝脏)。目前通过注射等或维生素制剂补充叶酸。然而，在规律饮食以外注射这些维生素是昂贵的并且不是总被接受的。
叶酸是大量的不同的叶酸衍生物的通用名词，它们在氧化状态，蝶呤环的单碳的取代物和谷氨酸残基的数目上有所差异。这些差异与不同的物理化学特性相关，这些特性和特定的食物成分一起可以影响叶酸的生物利用度。叶酸的生物利用度的一个重要因素是叶酸的稳定性。暴露于氧、热及最重要的胃的酸性的胃酸环境增加了叶酸的不稳定性。食物中存在的抗氧化剂如抗坏血酸和还原型巯基保护性地对抗了这种不稳定性。
影响叶酸稳定性的另一个因素是叶酸中存在的多谷氨酸残基(polyglutamyl residue)。已知的信息说明单谷氨酰叶酸(MGF)的生物利用度比多谷氨酰叶酸的生物利用度高。多谷氨酰叶酸在被肠道吸收之前必须被水解为相应的单谷氨酸衍生物。肠道的水解酶催化了这种转化。然而，这些酶可以被在一些食物中发现的成分所抑制。另外，谷氨酸链的长度也可以影响这些酶的活性(Gregory 1989)。可以推断单谷氨酸衍生物的叶酸的存在增加了叶酸的生物利用度。
叶酸存在于食品中，如肉、蔬菜和奶制品。食品之间的单谷氨酰叶酸及所致的叶酸的生物利用度是相当不同的，例如分析了蛋黄(72％单谷氨酰叶酸，MGF)，牛肝(56％MGF)，橙汁(21％MGF)，卷心菜(6％MGF)，扁豆(5％MGF)，以及莴笋(小于1％MGF)(Seyoum和Selhub，1998)。
乳酸细菌细胞内储存的叶酸主要是以多谷氨酰叶酸的形式存在。微生物中多谷氨酰叶酸的谷氨酸末端的一个功能是将叶酸滞留在细胞内(Shance和Stokstad，1975)。因此，在细菌通过胃肠道期间，多谷氨酰叶酸仍在细菌内以致不能被人体摄取是可能的。通过增加单谷氨酰叶酸的量以减少细胞内储存的叶酸的滞留可以解决这个问题。
前体GTP、对氨基苯甲酸和谷氨酸通过一个多酶途径(见图1)可以合成叶酸。在多个微生物中，包括乳酸细菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，编码这个途径的基因-gch，folC，folP，dhna，hppk和dhfr被组合在基因簇中。GTP环化水解酶I(gch，EC 3.5.4.16)，催化从GTP通过中间物(intermediate)到二氢新蝶呤三磷酸酯并释放出甲酸的反应。然后可能通过磷酸酶(Pase)的作用去除一个磷酸残基。二氢蝶呤醛缩酶(EC 4.1.2.25)作用于先前的反应产物合成羟乙醛和6-羟甲基-7，8-二氢蝶呤，其被2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶呤焦磷酸酶(hppk，EC 2.5.1.15)转化为6-羟甲基-7，8-二氢蝶呤焦磷酸。二氢蝶呤合成酶(dps，folP，EC 2.7.6.3)结合对氨基苯甲酸生成7，8-二氢蝶呤。叶酸合成酶(folC，EC 6.3.2.17)将谷氨酸结合到二氢蝶呤以生成二氢叶酸。在被二氢叶酸还原酶(dhfr，EC 1.5.1.3)进一步还原为四氢叶酸后，叶酰多谷氨酸合成酶(folC，EC 6.3.2.17)将谷氨酸添加到先前结合的谷氨酸残基的侧链的羧基上，最后生成多谷氨酸四氢叶酸(未在图1中显示)。
WO 01/00845包含了参与谷氨酸棒状杆菌的叶酸合成的四种酶的序列信息，这四种酶是GTP环化水解酶I(Fol E)，二氢蝶呤合成酶(Fol B)，二氢蝶呤醛缩酶(Fol P)和2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶呤焦磷酸酶(Fol K)。其也建议将这些棒状杆菌基因转化到棒状杆菌或其他的微生物，但是它没有任何关于使用哪个特异的基因或预期到何种结果的方案。而且，编码这些酶的基因的基因组结构在棒状杆菌这一方面和另一方面其他微生物，如杆菌，乳酸细菌，及酵母之间有着很大的差异。
发明内容
现在已经发现可以制备出不仅能够产生更多的叶酸、还能够产生生物可利用形式的叶酸的微生物。因此，本发明提供了一种重组的食品级微生物，其能生产多谷氨酰叶酸，并包括一个活性的异源的或同源的γ-谷氨酰水解酶基因，或者提供了一种修饰的微生物，它不仅能通过个别的生物合成基因的过度表达来产生更多的叶酸，也产生相对少量的多谷氨酰叶酸，因此有利于叶酸分泌到外部。本发明进一步提供了表达盒，其包括γ-谷氨酰水解酶基因或一种生物合成基因例如GTP环化水解酶基因及合适的、优选地为微生物的调节序列，以及提供了一种通过培养包含这样的表达盒并产生叶酸的微生物来生产叶酸的方法。本发明也提供了包含生产高产量的生物可利用叶酸的微生物的食品，特别是奶制品例如酸奶和其他发酵食品。
具体实施例方式
本发明涉及增加叶酸的产量，及特别是生物可利用叶酸的产量，生物可利用叶酸也就是哺乳动物胃肠道容易吸收的叶酸。本发明涉及各种叶酸衍生物的更高产量以及将比如微生物体内产生的各种多谷氨酰叶酸衍生物转化为相应的单谷氨酰叶酸衍生物。本发明的主要结果有三点—首先，本发明改变了多谷氨酸和单谷氨酰叶酸衍生物的比例，使其有利于单谷氨酰叶酸衍生物，因此增加了叶酸总的生物利用度且特别是单谷氨酰叶酸衍生物的生物利用度。
—第二，本发明限制了叶酸衍生物在产叶酸的宿主细胞的细胞内的滞留，强化了叶酸向细胞外环境扩散或转运的增加。鉴于细胞内储存的叶酸不能被哺乳动物胃肠道所摄取，因此上述结果增加了叶酸的生物利用度。
—第三，本发明使得细胞能生产更多量的总叶酸。
因此本发明涉及一种微生物，它能通过参与单谷氨酰叶酸生物合成的同源或异源酶的过度表达，或包含一种活性的异源谷氨酰水解酶基因来生产更高水平的细胞内叶酸。活性的谷氨酰水解酶基因理解为一种表达后产生一种能将多谷氨酰叶酸降解为单谷氨酰叶酸的酶的基因。
依照本发明，使用的叶酸生物合成基因可以是以下的叶酸基因簇的基因中的一种GTP环化水解酶I(gch)，二氢蝶呤醛缩酶(dhna)，和2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶呤焦磷酸酶(hppk)，或它们的混合物，如gch和hppk。酶活性的改变可以是上述的基因所编码的酶表达改变的结果，例如，通过存在多个同源或异源基因拷贝，和/或通过存在这些基因的强启动子。改变的活性可以是活性的增强，或活性的减弱，每个都造成单谷氨酰叶酸产量的相对增加。
已经发现二氢蝶呤合成酶(dps)或叶酸合成酶(folC)表达的增加没有导致叶酸产量的增加，以及二氢叶酸还原酶(dhfr)表达的增加甚至造成叶酸产量的减少。依照本发明，最优选的增加叶酸产量的基因是gch。
谷氨酰水解酶可以是一种内肽酶，也就是谷氨酰水解酶作用于多谷氨酸链的内部，单一步骤造成多谷氨酸链的去除。谷氨酰水解酶也可以是一种外肽酶，也就是一种从多谷氨酸链末端分离谷氨酸残基的酶，它造成重复步骤地去除单谷氨酸残基。内-谷氨酰水解酶基因可以来源于例如大鼠，反之可以得到外-谷氨酰水解酶基因，例如来自人源。
导入微生物的谷氨酰水解酶基因和叶酸生物合成的基因可以是原始的(未修饰的)基因。它们也可以是修饰的基因，它们至少包括编码谷氨酰水解酶和叶酸生物合成酶的催化域的序列。具体地，异源基因编码的谷氨酰水解酶与Yao等在Proc.Natl.Acad.Sci.美国，1996，93(19)10134-8及生物化学杂志1996 271(15)8525-8中所描述的大鼠或人γ-谷氨酰水解酶的氨基酸序列有着至少65％的序列相同性，特别是至少75％的相同性，如同利用传统的BLAST算法所确定的；和/或编码的序列在严格的条件下能和Yao等描述的核酸序列杂交。
名词“叶酸”覆盖了叶酸及其所有的盐，酯和衍生物，包括它们的甲基化衍生物。名词“多谷氨酰叶酸”指的是在它们的侧链上有着至少两个连续的谷氨酸残基的叶酸，反之“单谷氨酰叶酸”指的是那些叶酸中相当比例的叶酸，也就是至少25％的叶酸分子，只有一个谷氨酸基团。
因此本发明涉及来源于蔬菜、植物、真菌或细菌的编码γ-谷氨酰水解酶的基因或叶酸生物合成基因在食品级微生物的细胞内的表达，产生细胞内水解γ-谷氨酸的活性。特别优选的是γ-谷氨酰水解酶来自大鼠(Yao等，1996a)，人(Yao等，1996b，美国5,801,031)，鼠耳芥(arabidopsis thaliana)(Huangpu等，1996)，大豆(Huangpu等，1996)及来自革兰氏阳性细菌枯草芽胞杆菌(Margot等，1999)，球形芽胞杆菌(Hourdou等，1992)，和Bacillus intermedius(Leshchinskaya等，1997)以及与这些蛋白有着至少65％甚至75％序列相同性的功能相当的水解酶。在更多的细节上，本发明基于将编码所述的γ-谷氨酰水解酶的基因整合于食品级微生物的质粒或染色体内，由此得到了可以是组成性的或依赖于诱导的有效的基因表达。
本发明也涉及编码γ-谷氨酰水解酶的基因或上述编码叶酸生物合成的基因以获得完全或部分活性的酶的方式表达。这些酶的活性都引起多谷氨酰叶酸衍生物的降解。在这个反应中，酶性地从多谷氨酰叶酸衍生物水解掉单-和/或多-谷氨酸残基以生成单谷氨酰叶酸衍生物，或者按只包括单-谷氨酸残基的方式合成叶酸。
因此，本发明允许增加总的叶酸产量及特别是单谷氨酰叶酸衍生物的产量，这些单谷氨酰叶酸衍生物来自编码γ-谷氨酰水解酶的基因表达后的多谷氨酰叶酸衍生物，或者通过上述的叶酸生物合成基因的过度表达而直接合成没有连接多谷氨酸部分的单谷氨酰叶酸衍生物。这减少了细胞内多谷氨酰叶酸衍生物的滞留，使得增加了单谷氨酰叶酸的积极的或主动的通过细胞膜到细胞外环境的转运。因此，这造成发酵食品中常规叶酸衍生物和特殊的单谷氨酰叶酸衍生物的产量和生物利用度的增加。
如下面描述的实施例所显示，乳酸细菌细胞内的大鼠或人源γ-谷氨酰水解酶的表达和翻译造成多谷氨酰叶酸降解为单谷氨酰叶酸，细胞内叶酸滞留的减少，单谷氨酰叶酸的增加和细胞外叶酸的增加。因此根据本发明的产物和方法导致发酵食品中叶酸的生物利用度的增加。生物利用度的增加是两种现象的结果。第一，单谷氨酰叶酸的增加减少了降解多谷氨酰叶酸的天然肠道水解酶活性的必要性，它的优点在于因为肠道水解酶的活性对于某些食品成分是敏感的。第二，微生物所表达的γ-谷氨酰水解酶活性减少了叶酸在细胞内的滞留，造成细胞外叶酸浓度的增加，这对于乳酸细菌通过胃肠道期间仍是完整的且不能释放叶酸而言是有利的。另外，(单谷氨酸)叶酸从细胞外流的增加将增加总的叶酸生物合成率，这归结于反馈控制的减弱。
实施例2说明了在乳酸乳球菌中过度表达GTP-环化水解酶(EC3.5.4.16)和2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶呤焦磷酸酶(EC2.7.6.3)的作用。在乳酸乳球菌中，基因gch编码了一种具有这两种酶的双功能蛋白。该作用为使用重组乳酸乳球菌的培养基不仅增加了全部的叶酸产量，也特别地增加了单谷氨酰叶酸的产量和减少了多谷氨酰叶酸。这可以被相对低活性的叶酰多谷氨酸合成酶所解释，该酶由基因folC所编码，它没有足够高的活性去适应GTP-环化水解酶过度表达造成的更高水平的叶酸的生物合成。单谷氨酰叶酸更容易被乳酸乳球菌分泌，使得发酵培养基不仅有着叶酸水平的提高，也有着更多的以单谷氨酸形式被分泌到培养基的生物可利用形式。
尽管实施例1相关的γ-谷氨酰水解酶是来自大鼠或人源以及将乳酸乳球菌株NZ9000做为产(多/单)谷氨酰叶酸的乳酸细菌，但是本发明也覆盖任何其他的通常的γ-谷氨酰水解酶及特别是食品级γ-谷氨酰水解酶。能在乳酸细菌中表达的其他的γ-谷氨酰水解酶的例子可以是鼠耳芥属(arabidopsis)、大豆或中间杆菌来源。本发明也覆盖所述的γ-谷氨酰水解酶在除了乳酸乳球菌株NZ9000外的其他食品级微生物中的表达，例如其他乳酸杆菌，酵母和真菌。在这些实施例中，成熟大鼠或人γ-谷氨酰水解酶基因是克隆于乳链球菌素诱导启动子的下游。本发明也覆盖了在不同的诱导启动子控制下的γ-谷氨酰水解酶的表达，例如存在于乳酸操纵子中的启动子(Van Rooijen等1990，1992)，或组合的启动子，例如pepN基因(Tan等1992)。
尽管实施例2是关于乳酸乳球菌中同源gch基因编码的GTP环化水解酶的过度表达，造成了更高的叶酸产量和单谷氨酰叶酸相对于多谷氨酰叶酸的特异性的增加，但是本发明也覆盖了乳酸乳球菌中其他的同源或异源叶酸生物合成基因的过度表达，例如dhna和/或hppk，但不包括folP(dps)，folC或dhfr。另外，本发明覆盖了这些叶酸生物合成基因在除了乳酸乳球菌株NZ9000外的其他食品级微生物中的表达，例如其他乳酸杆菌，酵母和真菌。在实施例2中，gch基因克隆于乳链球菌素诱导启动子的下游。本发明也覆盖了在不同的诱导启动子的控制下的γ-谷氨酰水解酶和其他任意的叶酸生物合成酶的表达，例如存在于乳酸操纵子的启动子(Van Rooijen等1990，1992)，或组成性的启动子，例如位于pepN基因前的启动子(Tan等1992)。
实施例1材料和方法利用聚合酶链反应从克隆于载体pCR2的全长cDNA(Yao等，1996a)中获得成熟内肽酶人γ-谷氨酰水解酶。载体由纽约AlbanyWadsworth中心的分子诊断实验室提供。利用以下的引物获得编码成熟人γ-谷氨酰水解酶的885碱基对的PCR产物HGH-f(CATGCCATGGGACCCCACGGCGACACCGCCAAG)和HGH-r(GCTCTAGATCAATCAAATATGTAACATTGCTG)。
在5’末端延伸正向引物以生成一个NcoI限制性位点，该位点能与载体pNZ8048的乳链球菌素诱导启动子进行转录融合(Kuipers等)。使用所述的正向引物造成了成熟基因的轻微修饰(核苷酸用斜体字表示)。反向的引物在3’末端延伸以生成一个XbaI限制性位点，该位点能与载体pNZ8048进行粘性末端连接。带有成熟人γ-谷氨酰水解酶基因的新合成的载体被命名为pNZ7001。
利用聚合酶链反应从克隆于载体pCR2的全长cDNA(Yao等，1996a)中获得成熟内肽酶大鼠γ-谷氨酰水解酶。载体由纽约AlbanyWadsworth中心的分子诊断实验室提供。利用以下的引物获得编码成熟大鼠γ-谷氨酰水解酶的884碱基对的PCR产物HGH-f(CATGCCA TGGGATCCTATGAGCGCGGCTCCAAG)和HGH-r(GCTCTAGATCAGTTAAACATATAAGCTTGCTG)。
在5’末端延伸正向引物以生成一个NcoI限制性位点，该位点能与载体pNZ8048的NIS诱导启动子进行转录融合。使用所述的正向引物造成了成熟基因的轻微修饰(核苷酸用斜体字表示)。将钝性末端的PCR产物克隆于载体PCR的钝端(Invitrogen)并转化到大肠杆菌内。分离部分消化的NcoI-KpnI片段并连接到pNZ8048。带有成熟大鼠γ-谷氨酰水解酶基因的新合成的载体被命名为pNZ7002。
利用电穿孔将带有成熟大鼠或人γ-谷氨酰水解酶基因的载体转化到在染色体上带有nisR和nisK基因的乳酸乳球菌株NZ9000中。利用以下的NICE系统(乳链菌肽(nisin)诱导控制的表达)方案(DeRuyter等，1996)获得成熟大鼠或人γ-谷氨酰水解酶基因的表达。用于人或大鼠γ-谷氨酰水解酶基因表达和翻译的乳链菌肽的浓度为0.1到5ng/ml之间。利用纽约Albany Wadsworth中心分子诊断实验室提供的多克隆抗体进行人γ-谷氨酰水解酶的Western印迹分析。
将带有pNZ700 1或pNZ7002的乳酸乳球菌株NZ9000培养在5mlM17(Terzaghi和Sandine 1975)中以测定成熟大鼠或人γ-谷氨酰水解酶的活性。M17中补充有0.5％(重量/体积)葡萄糖(GM17)和10μg/ml氯霉素。加入GM17直到OD600为0.5。在OD600＝0.5时，加入乳链菌肽(1.0ng/ml)以诱导成熟大鼠或人γ-谷氨酰水解酶基因的表达。培养两小时后，用硅珠和FP 120 fastprepTM细胞裂解器(SavantInstruments公司，Holbrook，纽约，美国)制得20倍浓缩的细胞提取液(1ml 0.1M巯基乙醇，0.1M Na-PO4缓冲液，pH7.0)。将500μl浓缩的细胞提取物加入到作为多谷氨酰叶酸衍生物来源的酵母提取溶液中(0.5g/l酵母提取物(Difco实验室，Detroit，美国)，20ml 0.1MNa-PO4缓冲液，pH7.0，1％抗坏血酸)。在37℃连续孵育4小时，定时取出样品。将样品在100℃加热10分钟以终止反应。利用Horne和Patterson(1988)描述的干酪乳杆菌微生物测定法测定叶酸浓度。用转化有pNZ8048(空的乳链菌肽表达盒)的NZ9000菌株做为实验的阴性对照。
将带有pNZ7001或pNZ7002的乳酸乳球菌株NZ9000培养在M17(Terzaghi和Sandine 1975)中以测定成熟大鼠或人γ-谷氨酰水解酶的活性。M17中补充有0.5％(重量/体积)葡萄糖(GM17)和10μg/ml氯霉素。在OD600＝0.5时，加入乳链菌肽(1.0ng/ml)并定时将生长培养基取样。将标本离心直到细胞能与上清分开。用0.1M乙酸钠缓冲液pH4.8和1％抗坏血酸1∶1稀释上清。用0.1M乙酸钠缓冲液pH4.8和1％抗坏血酸洗涤细胞，并重新悬浮在原体积的0.1M乙酸钠缓冲液pH 4.8和1％抗坏血酸中。将所有的标本在100℃加热10分钟，随后利用Horne和Patterson(1988)描述的干酪乳杆菌微生物测定法测定叶酸浓度。将样品与做为γ-谷氨酰水解酶来源的人血浆(Sigma-Aldrich Chemie，Zwijndrecht，NL)在37℃孵育4小时以分析多谷氨酰叶酸的存在，随后进行叶酸浓度的测定。
结果加入1.0ng/ml的乳链菌肽能在利用多克隆抗体的western印迹上观察到表达的人γ-谷氨酰水解酶基因的表达产物。由于没有获得特异性的抗体，因此没有在western印迹上看见大鼠γ-谷氨酰水解酶。
体外测定人γ-谷氨酰水解酶的功能表达微生物叶酸测定法主要检测具有三个或更少的谷氨酸残基的叶酸衍生物。相应于叶酸链的长度，检测的微生物对更长链叶酸(n＞3)的生长效应显著降低。因此，对于包含多于三个谷氨酸残基的多谷氨酰叶酸的样品，例如主要含七谷氨酰叶酸的酵母提取物(Bassett等，1976)，只有当多谷氨酸末端被去除后才能用微生物测定法检测叶酸。因此，酵母提取物被用于测定乳酸乳球菌中人γ-谷氨酰水解酶的功能表达。加入乳链菌肽诱导的带有pNZ7001或pNZ7002的乳酸乳球菌株NZ9000的细胞提取物形成多谷氨酰叶酸的水解物，该水解物可以被微生物测定法检测到。加入带有pNZ8048(空的乳链菌肽表达盒)的乳酸乳球菌株NZ9000的细胞提取物没有显示出任何水解活性(图2)。
体内测定γ-谷氨酰水解酶的细胞内表达带有pNZ7001或pNZ7002或pNZ8048(空的乳链菌肽表达盒)的NZ9000菌株显示出相同的生长特性。在OD600为0.5时用乳链菌肽诱导不影响生长率。测定用乳链菌肽诱导后菌株的上清液和细胞提取物的叶酸浓度。带有pNZ7001或pNZ7002的乳酸乳球菌株NZ9000的特征是在生长期间细胞外叶酸浓度增加。带有pNZ8048的乳酸乳球菌株NZ9000的细胞外叶酸浓度在生长期间仍恒定不变。与对照菌株细胞内的叶酸浓度相反，表达γ-谷氨酰水解酶的菌株的细胞内叶酸浓度在生长期间没有增加。图3显示了用乳链菌肽诱导2小时后细胞内和细胞外叶酸的分布。菌株NZ9000-pNZ7002有着最高的细胞外叶酸浓度，这可能归结于大鼠γ-谷氨酰水解酶能快速地将多谷氨酰叶酸转换为单谷氨酰叶酸的内肽酶活性。人γ-谷氨酰水解酶的外肽酶活性是将多谷氨酰叶酸经过更短的多谷氨酰叶酸再转换为单谷氨酰叶酸。也检测了细胞提取物中存在的细胞内储存的多谷氨酰叶酸。利用微生物测定法测定了与做为γ-谷氨酰水解酶来源的人血浆孵育后的叶酸水平。菌株NZ9000-pNZ7001和NZ9000-pNZ7002没有包含多谷氨酰叶酸以及在生长期间叶酸的浓度没有改变。菌株NZ9000-pNZ8048的细胞内叶酸浓度部分包括多谷氨酰叶酸，见图3。存在于GM17细菌培养基的酵母提取物的多谷氨酰叶酸通常引起早期解离后菌株的发酵培养基的细胞外叶酸浓度的增加。从结果中可以推断表达的γ-谷氨酰水解酶的酶活性水解了细胞内多谷氨酰叶酸，造成细胞内叶酸衍生物滞留的减少并造成细胞外叶酸浓度的增加。
编码人和大鼠γ-谷氨酰水解酶的基因的DNA序列信息见Yao等，1996a和b的参考文献。
实施例2材料和方法用序列分析鉴定编码GTP环化水解酶的基因gch，以及用非重复基因组数据库将编码二氢叶酸还原酶的dhfr基因和编码同型丝氨酸脱氢酶的dhom基因与乳酸乳球菌株MG1363的基因组的一部分进行同源性比较。用引物dhfrF(GGAAT TCCAT GGTTA TTGGA ATATGGGCAG AAG)和dhomR(CGATC CCGGG AAGCC CTGTG CCACTGTCCA A)扩增基因组的一个区域获得序列。引物来自基因库相应的保藏号X60681和X96988提供的序列信息。同源性研究发现扩增片段(总共长度近8kb)的一部分包含有GTP环化水解酶和2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶呤焦磷酸酶的序列信息。利用引物hppk-f2(CATGC CATGG GGCAA ACAAC TTATT TAAGC ATGGG)和gch-r3(GGGGT ACCGA TTCTT GATTA AGTTC TAAG)获得的PCR产物包含2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶呤焦磷酸酶的潜在的启动密码子和GTP环化水解酶的潜在的终止密码子，该产物被克隆于pNZ8048的NcoI和KpnI位点(Kuipers等)形成质粒pNZ7003。在5’末端延伸正向引物以生成一个NcoI限制性位点，该位点能与载体pNZ8048的NIS诱导启动子进行转录融合。使用所述的正向引物造成了原始gch基因的轻微修饰，在Met-1后面引入了一个额外的甘氨酸，而下一个氨基酸没有改变。在3’末端延伸反向的引物以生成一个KpnI限制性位点，该位点能与载体pNZ8048进行插入末端结合。利用电穿孔将该载体引入乳酸乳球菌株NZ9000中(De Ruyter等，1996)生成乳酸乳球菌株NZ9000-pNZ7003。NZ9000株表达稳定地整合于pepN位点的nisRk调节基因。通过将乳链菌肽加入到发酵培养基(DeRuyter等，1996)，从乳链菌肽启动子调节gch的表达。按Sambrook等描述的下面的标准方案进行限制性剪切、连接和转化。
GTP环化水解酶的酶活性的测定进行一种测定在乳酸乳球菌中是否活性表达GTP环化水解酶的酶的测定法。将NZ9000-pNZ7003的无细胞提取物做为酶的来源以及将商业获得的GTP做为底物。将Saizieu等(1995)最初描述方案的修改方案用于GTP环化水解酶的活性测定。带有pNZ7003的乳酸乳球菌NZ9000株生长于添加了0.5％(重量/体积)葡萄糖(GM17)和10μg/ml氯霉素的M17(Terzaghi和Sandine 1975)培养基中。在OD600＝0.5时，加入乳链菌肽(2ng/ml)。在OD600＝2.5时，从25ml培养基中收集细胞并溶解在1ml 0.1M pH6.5的磷酸钠缓冲液中。用硅珠和FP 120 fastprepTM细胞裂解器(Savant Instruments公司，Holbrook，纽约，美国)释放细胞内成分。在100mM Tris/HCl pH8，100mM KCl，1mM EDTA pH8，50iM GTP以及2％无细胞提取物中，30℃下测定GTP环化水解酶的活性。将定时样品在100℃加热10分钟以灭活酶。用HPLC分析GTP的消耗和产物的形成。将标本(25μl)应用于8μ1000的PL-SAX柱(多聚体实验室)，流速为1.2ml/分钟，以及洗脱缓冲液包括50mM磷酸，100mM氯化钠，pH6.5。用UV吸收法在254nm测定GTP的消耗；荧光法测定反应产物，激发波长为365nm，发射波长为466nm。(见图4)。
gch的过度表达将带有pNZ7003的乳酸乳球菌株NZ9000培养在M17培养基(Terzaghi和Sandine 1975)中以测定在增殖的乳酸细菌中编码GTP环化水解酶和2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶呤焦磷酸酶的gch基因的过度表达对叶酸产量的影响。M17中补充有0.5％(重量/体积)葡萄糖(GM17)和10μg/ml氯霉素。在OD600＝0.5时，加入乳链菌肽(2ng/ml)。在OD600为2.5时，将细胞培养物离心直到细胞能与上清分开。用0.1M乙酸钠缓冲液PH4.8和1％抗坏血酸1∶1稀释上清。用0.1M乙酸钠缓冲液pH4.8和1％抗坏血酸洗涤细胞，并重新悬浮在原体积的0.1M乙酸钠缓冲液pH4.8和1％抗坏血酸中。将标本在100℃加热10分钟，随后利用Horne和Patterson(1988)描述的干酪乳杆菌微生物测定法测定叶酸浓度。将样品与做为γ-谷氨酰水解酶来源的人血浆(Sigma-Aldrich Chemie，Zwijndrecht，NL)在37℃一起孵育4小时以分析多谷氨酰叶酸的存在，随后用干酪乳杆菌微生物测定法进行叶酸浓度的测定。
结果GTP环化水解酶的酶活性造成反应产物随加入GTP后的时间延长而增加(图4)。反应产物有着与以往报告的(滞留时间9.52分钟)〔Saizieu等(1995)〕一样的层析特征，并被认定为二氢蝶呤三磷酸酯，它是GTP环化水解酶的主要产物。反应混合物含有过量的GTP。NZ9000-pNZ7003的无细胞提取物测定出GTP浓度的减少和二氢蝶呤三磷酸酯的增加。含有NZ9000-pNZ8048菌株的无细胞提取物的对照反应没有表现出GTP的显著减少，也没有GTP转换产物的形成。
利用SDS-PAGE对乳链菌肽诱导的NZ9000-pNZ7003无细胞提取物的定性分析发现与对照菌株和NZ9000-pNZ8048比较，有40KD蛋白的过度生成。
利用乳链菌肽对NZ9000-pNZ7003菌株的增殖细胞的诱导发现与对照菌株NZ9000-pNZ8048比较，增加了细胞内和细胞外叶酸浓度(图5)。总的叶酸产量被加倍。绝大多数额外生成的叶酸都出现在生长培养基中，与对照菌株比较，细胞外叶酸浓度增加了将近20倍。细胞内叶酸浓度的增加是次重要的。对细胞内叶酸池的降解说明只有对照菌株细胞内的叶酸浓度是部分表现为多谷氨酰叶酸。过度生成GTP环化水解酶的菌株没有在细胞内或细胞外生成多谷氨酰叶酸形式的叶酸。
图1.叶酸生物合成途径。括号表示推测的反应中间物。三磷酸残基用(P)3表示。图表改编自Lacks等1995。
图2.在用乳链菌肽诱导的带有编码大鼠γ-谷氨酰水解酶的pNZ7001，或编码人γ-谷氨酰水解酶的pNZ7002或pNZ8048(空的表达盒)做为阴性对照的乳酸乳球菌株NZ9000的细胞提取物进行早期解离后，利用微生物测定法测定最适pH值下酵母提取物的叶酸浓度。
图3.在用乳链菌肽诱导指数增殖的细胞2小时后细胞内和细胞外叶酸的分布。显示了在用血浆的酶早期解离后叶酸的分布，早期解离区分出具有短谷氨酸残基和更长谷氨酸残基(N＞3)的叶酸衍生物。PNZ8048，RgH和Hgh相应的对应于具有质粒pNZ8048(空的表达盒)，pNZ7001(nisA启动子和成熟大鼠γ-谷氨酰水解酶基因)和pNZ7002(nisA启动子和成熟人γ-谷氨酰水解酶基因)。用微生物测定法测定叶酸浓度。
图4.用HPLC和荧光法(365nm激发，446nm发射)分析二氢蝶呤三磷酸酯的浓度以测定GTP环化水解酶的过度表达。图例含gch的NZ9000-pNZ7003菌株的无细胞提取物(◆)以及含NZ9000-pNZ8048的对照菌株()。
图5.过度表达gch的NZ9000-pNZ7003菌株和对照菌株NZ9000-pNZ8048(含空的质粒pNZ8048)的细胞内和细胞外叶酸浓度。在早期解离前后用微生物测定法测定叶酸浓度，以血浆为γ-谷氨酰水解酶的外部来源。
参考文献De Saizieu，A.，Vankan，P.and Van Loon，A.P.G.M.(1995)EnzymicCharacterization of Bacillus subtilis GTP Cyclohydrolase I.Journal ofBiochemistry 306371-377.
Gregory J.F.Chemical and nutritional aspects of folate researchanalytical procedures，methods of folate synthesis，stability，andbioavailability of dietary folates.Adv.Food Nutr.Res.1989；331-101.Home，D.W.，Patterson，D.Lactobacillus casei microbiological assay offolic acid derivatives in 96 well microtiter plates.Clin.Chem 34，2357-2359(1988)Huangpu，J.，Pak，J.H.，Graham，M.C.，Rickle，S.A.，Graham，J.S.Purification and molecular analysis of an extracellular gamma-glutamylhydrolase present in young tissues of the soybean plant.Biochem.Biophys.Res.Commun.226，1-6(1996)Kuipers O.P.，de Ruyter P.，Kleerebezem M.，and de Vos W.Quorumsensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria.1998；6415-21Lacks，S.A.，Greenberg，B.and Lopez，P.(1995)A Cluster of Four GenesEncoding Enzymes for Five Steps in the Folate Biosynthetic Pathway ofStreptococcuus pneumoniae.Journal of Bacteriology，66-74.
Leshchinskaya，I.B.，Shakirov，E.V.，Itskovitch，E.L.，Balaban，N.P.，Mardano，A.M.，Sharipova，M.R.，Blagova，E.V.，Levdikov，V.M.，Kuranova，I.P.，Rudenskaya，G.N.and Stepanov，V.M.(1997)Glutamylendopeptidase of Bacillus intermedius strain 3-19.Purification，properties，and crystaiiization.Biochemistry(Mosc)62903-908.
Rooijen，R.J.van，Gasson，M.J.，de Vos，W.M.Characterization of theLactococcus lactis lactose operon promotercontribution of flankingsequences and LacR repressor to promoter activity.J.Bacteriol.174(7)，2273-80(1992).
Rooijen，R.J.van，de Vos，W.M.Molecular cloning，transcriptionalanalysis，and nucleotide sequence of lacR，a gene encoding the repressorof the lactose phosphotransferase system of Lactococcus lactis.J BiolChem.265(30)，18499-503(1990).
Rosenberg I.H.，Godwin H.A.Inhibition of intestinal gamma-glutamylcarboxypeptidase by yeast nucleic acidan explanation of variabilty inutilization of dietary polyglutamyl folate.J.Clin.Investig.1971.
Ruyter P.G.de，Kuipers O.P.，de Vos W.M.Controlled gene expressionsystems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin.Appl.Environ.Microbiol.1996 Oct；62(10)3662-7.
Seyoum E，Selhub J Properties of food folates determined by stability andsusceptibility to intestinal pteroylpolyglutamate hydrolase action.J.Nutr.1998 Nov；128(11)1956-60Shane B.Folylpolyglutamate synthesis and role in the regulation ofone-carbon metabolism.Vitam Horm.1989；45263-335.
Tan，P.S.，van Alen-Boerrigter，I.J.，Poolman，B.，Siezen R.J.，de Vos，W.M.，Konings，W.N.Characterization of the Lactococcus lactis pepNgene encoding an aminopeptidase homologous to mammalianaminopeptidase N.FEBS Lett.1992 Jul 13；306(1)9-16.
Terzaghi，B.E.and Sandine W.E.Improved medium for lacticstreptococci and their bacteriophages.Appl.Microbiol.Biotechnol.1975；3817-22Yao，R.，Schneider，E.，Ryan，T.J.，Galivan，J.Human gamma-glutamylhydrolasecloning and characterization of the enzyme expressed in vitro.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996a Sep 17；93(19)10134-8.
Yao，R.，Nimec，Z.，Ryan，T.J.，Galivan，J.Identification，cloning，andsequencing of a cDNA coding for rat gamma-glutamyl hydrolase.J.Biol.Chem.1996b Apr 12；271(15)8525-8.
权利要求
1.一种遗传学修饰的食品级微生物，其中所述修饰导致产生的单谷氨酰叶酸的量相对于未修饰的微生物产生的量是增高的。
2.权利要求1的微生物，其中至少一种参与单谷氨酰叶酸合成的酶的活性是增高的。
3.权利要求2的微生物，其中所述的酶包括gch基因编码的GTP环化水解酶。
4.权利要求1的微生物，其中γ-谷氨酰水解酶的活性是增高的。
5.权利要求2或3的微生物，其中所述的增高的酶活性是存在相应基因的多个拷贝的结果。
6.权利要求2或3的微生物，其中所述的增高的酶活性是存在增强相应基因表达的启动子的结果。
7.权利要求1-6中任一项的微生物，其中所述的编码所述的酶活性的基因是动物来源的，特别是哺乳动物来源的。
8.权利要求1-6中任一项的微生物，其中所述的编码所述的酶活性的基因是植物来源的。
9.权利要求1-6中任一项的微生物，其中所述的编码所述的酶活性的基因是食品级微生物来源的，特别是来源于乳酸细菌或酵母。
10.权利要求1-9中任一项的微生物，其是一种乳酸细菌。
11.一种生产单谷氨酰叶酸的方法，其包括培养权利要求1-10中任一项的微生物及回收产生的叶酸。
12.一种向哺乳动物胃肠道提供生物可利用的叶酸的方法，包括施用有效量的权利要求1-10中任一项的微生物。
13.一种含权利要求1-10中任一项的微生物的食品。
14.权利要求13的食品，其是一种奶制品。
全文摘要
本发明提供了一种通过培养食品级微生物生产生物可利用叶酸(即单谷氨酰叶酸比例增加而多谷氨酰叶酸比例减少的叶酸)的方法，所述食品级微生物含有活性的异源或同源多谷氨酰水解酶活性或含有活性增高的叶酸生物合成酶。编码多谷氨酰水解酶和叶酸生物合成酶的基因可以是各种来源，例如来自啮齿动物或包括人的其他哺乳动物。本发明也提供了一种食品，尤其是含有这些产生单谷氨酰叶酸的微生物的奶制品。
文档编号C12N1/00GK1513056SQ02810974
公开日2004年7月14日 申请日期2002年5月28日 优先权日2001年5月28日
发明者威尔伯特·费克·亨里克斯·西比斯马, 威尔伯特 费克 亨里克斯 西比斯马, 休根霍尔兹, 杰罗恩·休根霍尔兹, 米劳, 伊格尔·米劳, 约翰娜 凯瑟琳娜 斯塔瑞恩布尔格, 玛丽亚·约翰娜·凯瑟琳娜·斯塔瑞恩布尔格, 克勒瑞比赞姆, 米希尔·克勒瑞比赞姆, 威廉.迈因德特.德－福斯, 跻虻绿 德-福斯 申请人:坎皮纳公司