一种利用GnRHR基因检测绵羊繁殖力的方法
【专利摘要】本发明提供的一种利用GnRHR基因检测绵羊繁殖力的方法，即找出显著影响绵羊繁殖力的分子标记。选取GnRHR基因作为绵羊繁殖力的候选基因，利用PCR-SSCP技术，检测策勒黑羊、吐鲁番黑羊品种中GnRHR基因外显子2的遗传多态性，并分析研究其碱基突变对于绵羊繁殖性状的影响，最终发现GnRHR基因外显子2区的碱基突变G230C，可降低绵羊繁殖力，同时通过选择基因型为GG的绵羊个体，淘汰基因型为GC、CC的绵羊个体，可选育提高绵羊的繁殖力。
【专利说明】—种利用GnRHR基因检测绵羊繁殖力的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子标记技术，利用GnRHR基因检测绵羊繁殖力的方法以及在选育提高绵羊繁殖力中的应用，具有重要的生产价值。
【背景技术】
[0002]新疆作为我国的五大牧区，2013年的绵山羊存栏量达4161.52万只，具有丰富的绵羊品种资源，尤其是策勒黑羊、吐鲁番黑羊的优良地方绵羊品种，得到有效利用，因此结合新疆现有种质资源，提高绵羊的良种化程度，加大新疆的羊肉产量，是满足人民群众日益增长的需求的一个有效手段和根本方法。
[0003]促性腺激素释放激素受体(GonadotropinReleasing Hormone Receptor, GnRHR)是位于垂体促性腺细胞表面的一种高亲和性G蛋白耦联受体，可转导来自细胞外配位体、下丘脑因子下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone, GnRH)的信号，调节垂体前叶合成与释放促黄体素和促卵泡素，从而促进性腺的生长、成熟和调控生物的繁殖力。因此，GnRHR基因在调节哺乳动物生殖发育和机能中起着关键作用，是繁殖性状的一个重要生理候选基因。国外研究证实，绵羊的GnRHR基因位于6号染色体上，由3个外显子和2个内含子组成。研究表明，GnRHR基因的多态性引起的氨基酸序列的改变会影响配体GnRH和受体GnRHR的结合力，进而影响动物的发育和生殖能力。
[0004]目前，国内外对于绵羊GnRHR基因外显子2的多态性研究较少。刘忠慧等对小尾寒羊和多塞特羊2 个绵羊品种中GnRHR基因的外显子1和2进行了多态性检测，结果发现，GnRHR基因外显子2区域发生了突变G230C，该突变导致了甘氨酸改变为半胱氨酸。但该研究未对多态基因型和产羔数进行关联分析，无法判断GnRHR基因是否是影响小尾寒羊和多塞特羊繁殖力的主效基因。孙洁等对小尾寒羊和湖羊、南非肉用美利奴、考力代和中国美利奴绵羊中GnRHR基因的外显子1-3进行了多态性检测，结果表明，在小尾寒羊和湖羊中GnRHR基因外显子2存在2个突变(A50G和A101 )，均引起氨基酸改变，突变纯合型(DD)小尾寒羊平均产羔数比野生型(CC)多0.81只(P〈0.01)。
[0005]PCR-SSCP是以PCR为基础，基于DNA构象差别而进行快速、灵敏、有效检测基因点突变，检测基因多态性的常用方法。其基本原理是经PCR扩增的DNA片段在变性剂或低离子浓度下，经高温处理使之解链并保持在单链状态下，DNA单链可折叠成一定空间构象，在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，相同长度DNA单链因其碱基序列不同，甚至单个碱基不同，导致形成的构象不同，而且单链DNA构象的变化很可能引起了迁移率的改变，每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时，就会出现泳动变位，通过显色或显影后在凝胶上就会显示出带型的差别，即多态性。
[0006]本发明选取GnRHR基因作为绵羊繁殖力的候选基因，利用分子生物学技术PCR-SSCP，检测策勒黑羊、吐鲁番黑羊品种中GnRHR基因外显子2的遗传多态性，分析研究其碱基突变对于绵羊繁殖性状的影响，进而用于绵羊繁殖力的早期选育，这对于提高农牧民经济收入、加快新疆肉羊业的发展具有重要意义和实践应用价值。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于:提供利用PCR-SSCP技术检测，找出可显著影响绵羊繁殖力的分子标记，同时提供一种高效用于选育提高策勒黑羊和吐鲁番黑羊繁殖力的方法。
[0008]本发明的目的是这样实现的:一种利用GnRHR基因检测绵羊繁殖力的方法，分步骤实施；
[0009]提取策勒黑羊和吐鲁番黑羊基因组DNA，设计合成引物一对:上游引物F为5’ -CCTACAGTTATACATCTTTGGGA-3’，下游引物 R 为 5’ -TGAGAAATACATACTGTGGGGAT-3’，其扩增片段大小为241bp，最适退火温度为53.8°C ;PCR扩增反应体系:总体积为20 μ 1，其中PCR MixturelO μ 1，ddH208 μ 1，上下游引物各0.5 μ 1，DNA模板I μ I ；PCR扩增反应条件:94°C 5min, 30 个循环的 94°C 30s,53.8°C 30s,72°C lmin,72°C 5min，4。。保存；
[0010]采用PCR-SSCP技术，取3μ I PCR产物与7 μ I变性剂混合，放入PCR仪98°C IOmin进行变性，_20°C冷却IOmin后点样，8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳25h，银染显色后凝胶成像，分析带型，用以检测GnRHR基因外显子2区的遗传多态性，发现碱基突变G — C，位于外显子2区的第230位碱基，导致氨基酸改变的Gly — Ala,并产生的3种基因型:GG、GC和CC0
[0011]所述方法，选择基因型为GG的绵羊个体，用于选育提高绵羊的繁殖力。
[0012]本发明原理与作用:采集刚宰杀的策勒黑羊和吐鲁番黑羊颈静脉血样，枸橼酸钠抗凝，提取基因组DNA，参照文献，合成可扩增GnRHR基因外显子2区的一对引物，进行PCR扩增，利用SSCP技术检测GnRHR基因外显子2区的遗传多态性，判断基因型，对发现的不同基因型进行DNA测序，确定突变的碱基及位置，并与繁殖性状(产羔数)进行关联分析，最终确定、找出影响策勒黑羊和吐鲁番黑羊繁殖力的DNA分子标记，此外，通过检测出的基因型，留用携带具有高繁殖力潜能的基因型绵羊个体，以此选育提高绵羊的繁殖力；该方法快捷精准，应用性极强，彰显技术进步。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]本发明结合实施例作进一步说明。
[0014]附图1为PCR扩增产物电泳图；
[0015]如图所示:M为DL2000DNA Marker,泳道1-10为PCR扩增产物。
[0016]附图2为8%聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0017]如图所示:泳道8、9判定为GG基因型，泳道5、6判定为GC基因型，泳道1_4、7、10判定为CC基因型。
[0018]附图3为DNA测序结果对比图；
[0019]如图所示:在GnRHR基因外显子2区，发现了碱基突变G — C，致使野生纯合型GG变为突变纯合型Ce。
【具体实施方式】
[0020]本发明结合附图作进一步说明。
[0021]实施例[0022]1、基因组DNA提取:
[0023]采集刚宰杀的策勒黑羊和吐鲁番黑羊颈静脉血样5mL，枸橼酸钠抗凝，参照《分子克隆实验指南》，合成可扩增GnRHR基因外显子2;用酚氯仿抽提法提取血样基因组DNA，-20°C保存。
[0024](I)解冻血样，转移1000L至2.0ml离心管，加入等体积PBS缓冲液，温和摇动混匀；12000r/min离心IOmin,弃去上清液,重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。
[0025](2)在离心管中加入DNA抽提液5001，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37°C水浴Ih。
[0026](3)加蛋白酶K至101 (20mg/mL)并混匀，55°C过夜至澄清，尚未澄清者，可补加101蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。
[0027](4)将反应液冷却至室温，加Tris饱和酚5001，温和摇动混匀；12000r/min离心lOmin，将上清液转入另一 1.5ml离心管中，重复一次。
[0028](5)加三氯甲烷5001，充分混匀；12000r/mim离心lOmin，将上清液转入另一 1.5ml
离心管中。
[0029](6)加三氯甲烷、异戊醇混合液(24:1) 5001，充分混匀；12000r/min离心lOmin，将上清液转入另一 1.5ml离心管中。
[0030](7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇(_20°C )，温和转动离心管直至白色的絮 状沉淀析出，_20°C保存30min~60min。
[0031](8) 12000r/min离心lOmin，弃去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。
[0032](9) 12000r/min离心IOmin,弃去上清液,室温下使乙醇挥发干净。
[0033](10)干燥后的DNA溶于80~1001的超纯水中，4°C保存直至DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-20°C保存。
[0034]2、PCR 扩增:
[0035]I)引物设计及合成:根据绵羊GnRHR基因外显子2的DNA序列(GenBank登录号:L43841.1 )，参考文献《促性腺激素释放激素受体(GnRHR)基因多态性及其与济宁青山羊高繁殖力关系》的引物设计，送上海生物工程技术有限责任公司合成，引物序列如下:
[0036]上游引物F:5’-CCTACAGTTATACATCTTTGGGA-3’ ；
[0037]下游引物R: 5’ -TGAGAAATACATACTGTGGGGAT-3’ ；
[0038]2) PCR扩增反应体系:总体积为20 u 1，其中PCR MixturelOu 1，ddH208 U 1，上下游引物各0.5 yl，DNA模板I ill ;
[0039]3) PCR 扩增反应条件-MV 5min, 30 个循环的 94°C 30s,53.8°C 30s,72°C lmin,72 °C 5min，4°C 保存；
[0040]4)PCR扩增产物检测:用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色15min，凝胶成像仪成像，结果从图1中得出，条带清晰，无杂带，片段大小符合目的片段大小241bp。
[0041]其中主要试剂的配制:
[0042]20mg/ml蛋白酶K:1OOmg蛋白酶K溶于5ml超纯水，-20°C保存。
[0043]PBS 缓冲液:NaC18g, KC10.2g，Na2HPO4L 44g，KH2PO40.24g，加超纯水定容至1000ml,调pH至7.4,高压灭菌。
[0044]0.5mol/l EDTA:EDTA186.1g 溶于 800ml 的超纯水中，用 NaOH 调 pH 至 8.0，定容至1000ml，高压灭菌，4 V保存。
[0045]lmol/1 Tris.HCl:Tris 碱 121.14g 溶于 800ml 超纯水中，HCl 调节 pH 至 8.0，定容至1000ml，高压灭菌，4°C保存。
[0046]5mol/l NaCl:NaC1292.2g 溶于 1000ml 超纯水中。
[0047]10%SDS:10g SDS溶于90ml的超纯水中，68°C水浴溶解，用HCl调pH至?.2，定容至 100ml ο
[0048]DNA 抽提液:取 0.5mol/l EDTA40ml,lmol/1 Tris.HClIOml，5mol/lNaC14ml，10%SDS10ml，定容至100ml，高压灭菌，4°C保存。
[0049]70%乙醇:无水乙醇70ml,加超纯水定容至100ml。
[0050]10XTBE:Trisl08g，硼酸 55g，EDTA.2H207.44g，加超纯水定容至 1000ml。
[0051]IXTBE:10 X TBElOml，加超纯水定容至 100ml。
[0052]0.8%琼脂糖凝胶配方:0.4g琼脂粉溶于50mll XTBE，放于微波炉内加热1.5min
充分溶解，备用。
[0053]2.5%琼脂糖凝胶配方:2.5g琼脂粉溶于100mlI X TBE,放于微波炉内加热3min充
分溶解，备用。
[0054]其中实验选用的Taq DNA聚合酶、蛋白酶K、dNTPs、10 X PCR Buffer、溴化乙锭(EB)由新疆宝信提供；6XLoading Buffer,Marker I 由庄盟生物提供；NaC1、KC1、Na2HPO4、KH2PO4, SDS、Tris.HCl、NaCl、Tris饱和酚、EDTA、三氯甲烷、无水乙醇、硼酸、二甲苯氰FF、过硫酸铵、溴酚蓝、琼脂糖、超纯水、离心管、枪头由博迈德生物提供。
[0055]3、SSCP 检测:
[0056]取3 μ I PCR产物，与7 μ I变性剂混合，放入PCR仪中进行变性(98°C lOmin)，取出后立即置于冰上，放入-20°C冰箱，IOmin后取出点样，进行8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电压180V，电流50mA，根据PCR扩增产物的大小，电泳25h。
[0057]经银染显色后，凝胶成像仪成像，结果从图2中得出，GnRHR基因外显子2具有多态性，存在三种基因型:GG、GC和CC。
[0058]4、DNA 测序:
[0059]将三种不同基因型的PCR产物送上海生工测序，根据测序结果分析突变碱基及位点，测序结果如图3。从图中可以看出，在GnRHR基因外显子2区(共275bp)发现了碱基突变G — C。进一步分析发现，该突变位点位于外显子2区的第230位碱基，并导致了氨基酸的改变Gly — Ala。
[0060]5、数据统计分析:
[0061]利用软件SPSS17.0,分析比较不同基因型间，总体平均产羔数的差异，结果如下表。
[0062]表
[0063]
【权利要求】
1.一种利用GnRHR基因检测绵羊繁殖力的方法，其特征在于:分步骤实施； 提取策勒黑羊和吐鲁番黑羊基因组DNA，设计合成引物一对:上游引物F为5’ -CCTACAGTTATACATCTTTGGGA-3’，下游引物 R 为 5’ -TGAGAAATACATACTGTGGGGAT-3’ ;扩增片段大小为241 bp，最适退火温度为53.80C ； PCR扩增反应体系:总体积为20u I, PCR Mixture IOu I, ddH20 8 yl，上下游引物各0.5 u I, DNA 模板 I u I ; PCR 扩增反应条件:94°C 5 min, 30 个循环的 94°C 30 s、53.8°C 30 s、72°C I min,72°C 5 min, 4°C 保存； 采用PCR-SSCP技术，取3 u I PCR产物与7 U I变性剂混合，放入PCR仪98°C 10 min进行变性，_20°C冷却10 min后点样，8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳25 h，银染显色后凝胶成像，分析带型，用以检测GnRHR基因外显子2区的遗传多态性，发现碱基突变G — C，位于外显子2区的第230位碱基，导致氨基酸改变的Gly — Ala,并产生的3种基因型为:GG、GC和CC。
2.依据权利I所述方法，其特征在于:选择基因型为GG的绵羊个体，用于选育提高绵羊的繁殖力。`
【文档编号】C12Q1/68GK103740804SQ201310514882
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】刘武军, 邵勇钢, 王琼, 田佳, 努孜古丽·图尔荪 申请人:刘武军, 新疆农业大学