一种与伊犁马乳用性状相关的snp标记及其检测方法
【专利摘要】本发明提供的一种与伊犁马乳用性状相关的SNP标记及其检测方法,该SNP标记为位于马21号染色体上第29764513位的碱基，此处碱基为G的伊犁马日均产奶量显著高于此处碱基为A的伊犁马,利用分子标记技术，检测待测伊犁马的基因型，根据基因型进行伊犁马产奶量的选育，从而加速新疆专门化乳用马品种的培育。
【专利说明】一种与伊犁马乳用性状相关的SNP标记及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物分子遗传育种，利用DNA分子标记技术检测与伊犁马乳用性状相关性，选育提高伊犁马产奶量的方法。
【背景技术】
[0002]马奶其性味甘凉，营养价值在各类乳品中是最高，含有蛋白质、脂肪、糖类、磷、钙、钾、钠、维生素A、维生素B1-B2、维生素C、尼克酸、肌醇等多种丰富的维生素和矿物质，容易被人体消化吸收，具有补虚强身、润燥美肤、清热止渴的作用，由于马奶内只含1.5%的脂肪，比牛奶的脂肪含量少了一倍。马奶发酵酿成的马奶酒，不但清凉可口，富有营养，还能起到滋脾养胃、除湿、利便、消肿等作用，对治疗肺病效果更佳，为此，欧洲还将马奶酒饮疗法作为临床疗法之一，但我国欠缺专门化的乳用马品种，马的产奶量远远低于牛的产奶量，无法满足市场需求，因此，多元化发展马产业、提高我国马的专门化水平、提供乳用性能突出的马匹是解决这一问题的有效途径。
[0003]目前，对分子育种工作理论的研究重点之一是利用目的性状与标记间的关联性进行标记辅助选择，SNP(Single Nucleotide Polymorphism,单核苷酸多态性)遗传标记作为第三阶段以DNA测序为核心的分子标记，其特点是单个碱基的置换，不是以长度的差异作为区分的遗传标记，由于SNP分布密集，随着越来越多的SNP位点被发现，SNP己成为极具应用前景的遗传标记物。发现SNP位点是SNP标记的关键工作，检测SNP的方法很多，其中SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism,单链构象多态性)是近年来发展起来的一种基因多态性检测技术，即应用PCR-SSCP技术对控制家畜性状的基因进行分型，联合经济性状的遗传规律进行分析，可能找到与经济性状相连锁的重要标记基因，做到真正的早期选种、准确选种。PRL(Prolactin,催乳素)和PRLR(Prolactin Receptor,催乳素受体)主要由垂体的催乳素细胞 分泌，广泛作用于动物的乳腺，刺激乳腺发育、促进泌乳，增强雌性动物的母性行为。近年来，PRL和PRLR基因作为家畜产奶性状的功能基因，其多态性研究(包括SNP位点的发现)已成为动物遗传育种研究的热点之一。
[0004]检索文献披露:①Viitala等研究了爱尔夏、芬兰牛PRLR第3外显子区域。②张佳兰对中国、加拿大、澳大利亚等4个奶牛群体研究发现，在第3、5、7、10外显子区域都发现了多态。③孙瑞萍等在对西农萨能奶山羊PRLR基因外显子10区域多态性相研究发现多态位点，发现P2、P3和P4扩增片段具有多态性，Pl则不存在多态性不同基因型与产奶性状的最小二乘均值差异显著。④姚新奎、热阳古?阿布拉等首次对新疆的伊犁马、新吉马及其杂交马3个品种的PRL和PRLR基因进行多态性研究，结果发现:PRL基因第5外显子、PRLR基因第4外显子存在多态，共发现5种基因型，检测到3个突变位点(T591G、C654T和C156T)，属于同义突变。对3个不同品种马群体PRL外显子5和PRLR外显子4多态基因型与产奶量的相关性研究表明:伊犁马群体内，2个基因不同基因型之间产奶量有显著差异，但是在新吉马和杂交马群体内，不同基因型个体之间产奶量差异不显著；马PRL基因外显子5、PRLR基因外显子4上的突变可能是影响伊犁马产奶性能的重要位点。⑤新疆中澳羊中心的贺三刚等申请的专利“伊犁马育种方法及其试剂盒”(专利申请号:201310040054.6)，公开采用该发明的方法和试剂盒能够显著提高伊犁马肉用新类群的体尺性状，即体高，体长，胸围和管围，加速伊犁马肉用新类群的培育。综上，国内外多集中在奶牛、奶山羊产奶性状的功能基因方面的研究报道。
[0005]本发明利用分子标记技术，提供了一种检测影响伊犁马乳用性状产奶量的SNP标记、并以标记辅助选择策略选育提高伊犁马产奶量的方法；检测的SNP标记位于马第21号染色体上总长度为194bp的第29764417-29764611位碱基之间，在PRLR基因附近，SNP位点为A>G。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于:提供一种利用分子标记技术检测影响新疆伊犁马乳用性状的SNP标记,并以标记辅助选择策略选育提高伊犁马产奶量的方法。
[0007]本发明的目的是这样实现的:一种与伊犁马乳用性状相关的SNP标记及其检测方法，
[0008]I)提取待测伊犁马的基因组DNA ;根据GenBank登录号为BIEC2-560774的序列，设计合成引物，上游引物为5’ -GGTTGCTATTCTGGGCTTTG-3’，下游引物为5’-TGTGTTGGGATGGACAAAAA-3’ ；扩增片段大小为194bp，最适退火温度为57.1°C ；
[0009]2)以待测伊犁马的基因组DNA为模板，对设计引物进行PCR扩增；
[0010]反应体系:PCR Mixturel0.0 μ 1，上下游引物各0.4 μ 1，DNA模板1.5 μ 1，加水至总体积20 μ I ;
[0011]反应条件:94°C预变性5min，94°C变性 30s,57.1°C 30s、72°C延伸 lmin，循环 30次，72。。延伸5min，4°C保存；
[0012]3)对扩增的PCR产物，进行SSCP检测；其中电泳的电压180V，电流50mA，时间IOh ；
[0013]4)选取个体的PCR产物，送往上海生物工程技术有限责任公司进行DNA测序，判定位于马21号染色体上第29764513位的碱基G的伊犁马日均产奶量显著高于碱基为A的伊
犁马日均产奶量。
[0014]所述方法，选择基因型为AB、BB的个体，用于乳用马品种的培育。
[0015]本发明的分子标记的方法，即用传统酚氯仿抽提法从血样中提取待测样本的绵羊基因组DNA，经特异性引物扩增得到目的片段，通过PCR-SSCP技术，目的片段经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显色，得到DNA的凝胶图谱，根据图谱中条带的数量和位置对待测样本的SNP位点进行基因判型，其判断结果是突变纯合体会在与野生型完全不同的位置显示2个条带，突变杂合体则在以上出现的位置同时出现4个条带，后经DNA测序，找出突变位点(即SNP位点)，确定碱基突变的位置。利用生物学统计软件SPSS17.0，对不同基因型间伊犁马的乳用性状(日均产奶量)进行显著性检验，经显著性检验分析，该SNP位点是否显著影响了伊犁马的产奶量，最终确定和找出影响伊犁马产奶量的SNP标记。
[0016]本方法选择基因型为AB、BB的个体，淘汰基因型为AA的个体，选育提高伊犁马的产奶量，用于专门化乳用马品种的培育，为新疆畜牧业的可持续发展提供了生产服务的平台，彰显技术进步。【专利附图】
【附图说明】
[0017]本发明结合实施例作进一步说明。
[0018]附图1为PCR扩增产物电泳图；
[0019]如图所示:M为DL2000DNA Marker,泳道1_10为用传统酚氯仿抽提法从血样中提取基因组DNA后进行PCR扩增的产物(194bp)。
[0020]附图2为8%聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0021]如图所示:泳道5判定为AA基因型，泳道1、4、6、8、9、10、12、13判定为AB基因型，泳道2、3、7、11判定为BB基因型。
[0022]附图3为DNA测序结果对比图；
[0023]如图所示:伊犁马第21号染色体上存在一个单核苷酸突变位点(g.29764513A>G)。
【具体实施方式】
[0024]本发明结合实施例作进一步说明。
[0025]实施例
[0026]一、马基因组DNA的提取
[0027]利用装有枸橼酸钠抗凝剂的采血管，将屠宰场采集伊犁马颈静脉血5ml，-20°C保存；
[0028]参照《分子克隆实验指南》，用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，4°C保存。
[0029]二、引物设计及合成
[0030]根据马的SNP位点(GenBank登录号:BIEC2_560774)，参照国外文献设计的特异性引物，在上海生物工程技术有限责任公司订购和合成引物。引物序列如下:
[0031]上游引物:5’-GGTTGCTATTCTGGGCTTTG-3’
[0032]下游引物:5，-TGTGTTGGGATGGACAAAAA-3，
[0033]引物大小:194bp
[0034]最适退火温度:57.10C
[0035]三、PCR扩增
[0036]I) PCR扩增反应体系，见表1。
[0037]
【权利要求】
1.一种与伊犁马乳用性状相关的SNP标记及其检测方法，其特征在于: O提取待测伊犁马的基因组DNA ;根据GenBank登录号为BIEC2-560774的序列，设计合成引物，上游引物为5’ - GGTTGCTATTCTGGGCTTTG-3’，下游引物为5’ -TGTGTTGGGATGGACAAAAA-3’ ；扩增片段大小为194bp，最适退火温度为57.1°C ； 2)以待测伊犁马的基因组DNA为模板，对设计引物进行PCR扩增； 反应体系:PCR Mixture 10.0 μ 1，上下游引物各0.4 μ 1，DNA模板1.5 μ 1，加水至总体积 20 μ I ; 反应条件:94°C预变性5min，94°C变性30s,57.TC 30s、72°C延伸lmin，循环30次，72°C 延伸 5min，4°C 保存； 3)对扩增的PCR产物，进行SSCP检测；其中电泳的电压180V，电流50 mA，时间10 h ； 4)选取个体的PCR产物，送往上海生物工程技术有限责任公司进行DNA测序，判定位于马21号染色体上第29764513位的碱基G的伊犁马日均产奶量显著高于碱基为A的伊犁马日均产奶量。
2.依据权利要求1所述SNP标记及其应用，其特征在于:选择基因型为AB、BB的个体，用于乳用马品种的培育。
【文档编号】C12N15/11GK103740805SQ201310514883
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】刘武军, 邵勇钢, 王琼, 莫合塔尔·夏甫开提, 孟军, 耿明, 刘玲玲 申请人:刘武军, 新疆农业大学