一种可增强固氮菌泌铵能力的基因的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种可增强固氮菌泌铵能力的基因。通过突变实验得到具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列的基因，将其转入可泌铵的斯氏假单胞菌A1561菌得到的菌株，经实验证实，具有比A1561菌株更高的固氮及泌铵能力。本发明的基因可应用于生产提供氮肥的微生物肥料。
【专利说明】—种可增强固氮菌泌铵能力的基因
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种可增强固氮菌泌铵能力的基因。
【背景技术】:
[0002]生物固氮的研究有助于增产粮食且不污染环境。泌铵菌向胞外环境分泌铵，为宿主植物提供一定量的氮素。
[0003]目前泌铵菌对于植物的促生作用的研究多局限于实验室环境下，应用于大田环境还要从以下几个因素对其进行改良:1)提高泌铵菌的根际定殖能力；2)结合态氮是抑制固定大气氮的主要因素，高铵条件下提高泌铵菌的固氮能力和耐铵能力；3)在土壤微生物菌群中使泌铵菌成为优势菌群；4)提高固氮能源的供给及优化其组成。
[0004]斯氏假单胞菌A1501 (Pseudomonas stutzeri A1501)是一株联合固氮菌，于 1980年分离于我国南方水稻田。该菌株虽然具有明显的固氮能力，但它们固定的氮素主要用来满足自身的生长需要，而提供给植物的氮素有限。特别是在外界有铵的情况下，所固定的氮就更少，甚至停止固氮及泌铵，这就限制了联合固氮菌的开发及在农业生产中的应用。
[0005]中国专利申请200910236131.9提供了一种重组泌铵菌，通过对斯氏假单胞菌A1501进行基因改造，缺失铵转运载体蛋白amtBl、amtB2基因，同时转入固氮酶正调苄基因(nif A)，该菌株命名为1561/pVA3，具有一定的泌铵能力。但对于固氮酶正调苄基因(nifA)进行突变，以提高其固氮和泌铵能力，获得高效固氮的泌铵菌还未见报道。
[0006]本文中所称的“斯氏假单胞菌”，亦可称为“施氏假单胞菌”。
【发明内容】
:
[0007]本发明的目的是用基因重组的手段对固氮酶正调苄基因(nif A)进行突变，并将其转入斯氏假单胞菌A1561菌，开发新的高效泌铵的联合固氮基因，以提供具有应用潜力的微生物菌肥。
[0008]本发明通过突变实验得到具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的nif AM基因，突变的基因可提高斯氏假单胞菌A1561泌铵量，并得到高效泌铵的联合固氮菌，证实了上述发现。
[0009]nif AM基因的获得及菌株构建具体方法如下:
[0010]1.基因克隆
[0011]提取斯氏假单胞菌A1501的基因组，以所提取的基因组为模板，通过PCR方法获得nif A基因。以nif A基因为模板，易错突变方法突变nif A基因。
[0012]2.载体构建
[0013]按常规方法克隆(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。克隆了固氮酶调苄基因(nif AM)，nif AM核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0014]将含有完整的nif AM的DNA片段连接到pVKlOO，构建了组成型表达质粒pVKAM。
[0015]3.三亲接合[0016]通过三亲本接合将不能自我转移的质粒导入受体菌中。
[0017]4.重组子的筛选及鉴定
[0018]挑出部分长出的菌落连续转三次平板后，进行菌落PCR鉴定。之后，对泌铵情况进行鉴定。
[0019]经采用靛酚蓝比色法进行测铵试验，并与菌株A1561、1561/pVA3相比较(见实施例3)，证实用本发明构建的联合固氮菌株可高效泌铵，进而可为农作物提供氮肥，是一种潜在的微生物肥料。
【专利附图】
【附图说明】:
[0020]图1为nif AM基因同源片段的扩增结果；
[0021 ] 图2为大肠杆菌重组载体pVKAM的物理图谱；
[0022]图3为工程菌1561/pVA3、A1561、1561/pVKAM泌铵比较。横坐标为培养天数，纵坐标为铵浓度。
[0023]序列表说明
[0024]1、SEQ ID NO:1nifAM 的 核苷酸；
[0025]2、SEQ ID NO: 2是从SEQ ID NO:1推导出的nif AM编码的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0026]以下实验中所用的实验材料说明及来源如下:
[0027]菌株与载体:
[0028]大肠杆菌菌株E.coli JM109购自Novagen公司；
[0029]斯氏假单胞菌A1561:由野生斯氏假单胞菌A1501缺失amtBl、amtB2基因后得到，来源于中国农业科学院生物技术所；
[0030]1561/pVA3菌株:为1561菌株中转入nif A基因(见中国专利申请200910236131.9)，来源于中国农业科学院生物技术所；
[0031]pVKlOO载体:由Knauf等人于构建，见杂志Plasmidl982年，8:45-54，以下实验用载体来源于中国农业科学院生物技术所。
[0032]酶与试剂盒:
[0033]限制性内切酶，连接酶，Taq酶为NEB公司产品。
[0034]基因组提取试剂盒为天根生化公司产品。
[0035]生化试剂:IPTG、X-Gal、SDS等试剂为Sigma公司产品。
[0036]培养基:大肠杆菌培养基为LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0)。A15限制性培养基:磷酸二氢钾0.4g，磷酸氢二钾0.1g,氯化钠0.1g,七水硫酸镁0.2g, 一水硫酸锰0.01g，一水硫酸铁0.01g，钥酸钠0.01g，乳酸钠6ml，硫酸铵0.4g定容至1000ml，调ρΗ6.8。用于液体培养，28°C摇床，180-200rpm，培养16~18h。A15无氮培养基:A15限制
性培养基中除去硫酸铵。
[0037]实施例中其它未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，如Sambrook等人的方法，分子克隆按(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0038]实施例1nifAM基因的获得[0039]提取斯氏假单胞菌A1501的基因组。以所提取的基因组为模板，进行PCR扩增。所使用的引物根据nifA基因的5’和3’端序列合成，2个引物序列分别为:
[0040]5， CCGAAGCTTTCAGATCTTGCGCATATGA3，和[0041 ] 5，CCGAAGCTTACGGTGCATATCGATAGC3，，
[0042]通过PCR方法获得完整的nifA基因，并包含nifA基因编码区上游约70bp的一段核苷酸序列，长为1.6kb的目的片段。以nifA基因为模板，使用Labest易错PCR突变试剂盒，突变nifA基因。获得突变后基因(图1)，命名nifAM。
[0043]实施例2用nifAM构建基因工程菌1561/pVKAM及验证
[0044]用Hind III酶切并回收nifAM片段，与同样酶切的穿梭载体pVKlOO连接。TcsKnf抗性筛选，提取质粒，Hind III及EcoR I酶切鉴定，重组质粒pVKAM图谱见图2。
[0045]分别将供体菌pVKAM，受体菌1561，帮助菌pRK2013按着1:1:1的比例混合，通过三亲结合的方法，将重组质粒PVKAM转入1561中，然后进行卡那霉素(Km)，四环素(Tc)抗性筛选。随机选取3个三亲结合子，提取质粒验证pVKAM是否转入1561中。受体菌1561为前期获得的突变株，缺失了 amtB基因。
[0046]提取质粒后，以质粒DNA为模板，进行PCR验证，得到1.6kb的片段，以提取1561的空质粒为阴性对照；同时将质粒通过EcoR I和Hind III酶切验证，分别切出两条带，从而得到了重组的工程菌，命名为1561/pVKAM。
[0047]实施例3nif AM泌铵作用验证比较
[0048]1、实验目的
[0049]通过定量比较转入nif AM基因的改造菌株与出发菌A1561、1561/pVA3的泌铵作用，验证nif AM基因的功能；
[0050]2、实验对象
[0051]实验菌株:转入nif AM基因的工程菌1561/pVKAM (实施例2得到的)；
[0052]2种对照菌株:出发菌A1561、转入nif A基因的工程菌A1561/pVA3。
[0053]3、实验方法
[0054]3.1NH4+浓度的测定按照靛酚蓝比色法(Bender et al.1977)，具体操作如下:
[0055]I)配制A溶液、B溶液
[0056]A 溶液(100ml):5g 苯酌? ；0.025g Na-nitroprusside (Na2Fe [CN] 5N0 ? 2H20)；
[0057]B 溶液(100ml):62.5mllM NaOH; 3.3ml NaOCl (有效氯 5.25%)。
[0058]2 )绘制NH4+浓度标准曲线
[0059]配制NH4+ 的系列稀释液(系列稀释 IM 的 NH4+ 为 0.1, 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2? OmM ;加入A、B溶液反应20min后，在OD625比色)
[0060]3)分别取100 U I实验菌和两种对照菌的细菌培养上清液，加入100 ill A溶液后再加入100 ill B溶液，20min后观察反应液颜色，通过与NH4+浓度标准曲线的颜色深浅相t匕，判断是否存有NH4+及其浓度。
[0061]4)将实验菌1561/pVKAM和两种对照菌分别接种于半固体无氮限制性培养基(1000ml, KH2PO40.4g, K2HP040.lg, NaCl0.lg, MgSO4.7H200.2g, MnS04.H2O0.01g, Fe2 (SO4) 3.H200.01g, Na2MoO4.H2O0.01g, C3H5Na036ml，加入 0.1%—0.2% 的琼脂，pH6.8)中，在充满 N2,0.5%02，30°C条件下培养15天后，采用乙炔还原法分别测定两种菌的固氮酶活，并用靛酚蓝法分别检测实验菌株和两种对照菌培养基中的泌铵量和PH值。
[0062]以上实验均重复3次以上。
[0063]3.2固氮活性测定，采用乙炔还原法测定，具体操作如下:
[0064]使用SP - 2305型气相色谱仪测定。将待测的各菌株同时活化，保持生长状态一致；将活化后的各菌株接入含相应抗生素的液体A15培养基，30°C振荡培养20h。测定各菌株的0D600值。从每个试管中取出适量菌液，4，000g，4°C离心lOmin，收集菌体。
[0065]用生理盐水洗涤菌体两次，充分悬浮于无氮A15液体培养基中，使0D600 = 1.0 ；每个小三角瓶加入9ml无氮A15液体培养基，接入Iml菌液，使菌液终浓度为0D600 = 0.1 ；将每个小三角型瓶塞入胶塞，注入纯氩气，同时排出空气。然后注入0.5%体积的氧气和10%体积新制的乙炔，30°C剧烈振荡培养，胁迫4h。每隔Ih从每个小血清瓶中用微量进样器取出0.25ml气体用气相色谱法测定乙烯含量，根据各样品乙烯峰的高低来比较其固氮酶活性高低。以上实验均重复3次以上。
[0066]固氮酶活=记录仪上乙烯峰的面积X (试管气相体积/进样量)/ (Inmol标准乙烯峰的面积X反应时间)
[0067]4、实验结果
[0068]I)固氮酶活
[0069]在固氮条件下，含nif AM基因的改造菌1561/pVKAM的固氮酶活为19.06U/mg，对照菌1561/pVA3的固氮酶活14`.24U/mg，对照菌A1561的固氮酶活为7.41U/mg, 1561/pVKAM为A1561固氮酶活的2.57倍。
[0070]2)培养基 pH
[0071]培养20天后，发现对照菌A1561培养基未显蓝色，即没有分泌铵，铵浓度为O，pH值7.10 ;而1561/pVKAM的培养基显蓝色，且泌铵量达到6.96mM,其培养基呈弱碱性(pH值=7.48) ；1561/pVA3的培养基显蓝色，且泌铵量达到5.15mM,其培养基呈弱碱性(pH值=7.42)。研究结果表明1561/pVKAM较1561/pVA3具有更强的固氮活力，并且能向细胞外分泌更多的铵。
[0072]结果如图3、表1所示。
[0073]表1三种菌泌铵作用比较
[0074]
【权利要求】
1.一种可增强固氮菌泌铵能力的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.含权利要求1所述基因的重组质粒。
3.权利要求2所述的质粒在生产具有固氮功能菌肥中的应用。
4.含权利要求1所述基因的载体。
5.用权利要求4所述的载体转化的宿主细胞。
6.含权利要求1所述基因的重组工程菌株。
7.权利要求6所述的菌株，是将权利要求1所述基因转入斯氏假单胞菌A1561菌得到。
8.权利要求6或7所述菌株在生产具有固氮功能菌肥中的应用。
9.权利要求1所述基因编码的蛋白，具有SEQID N0:2所示的氨基酸序列。
10.权利要求9`所述蛋白在生产具有固氮功能菌肥中的应用。
【文档编号】C12N15/31GK103525830SQ201310459866
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】平淑珍, 赵仲麟, 燕永亮, 陆伟, 林敏
申请人:中国农业科学院生物技术研究所