专利名称：海洋原索动物文昌鱼抗衰老相关的铁蛋白新基因的制作方法
技术领域：
本发明属于海洋动物抗衰老相关基因领域，特别是关于海洋原索动物文昌鱼的铁蛋白基因序列及功能蛋白质。
衰老是人类一直所关注的重大问题，延缓衰老、延长寿命是人类的共同愿望，寻找抗衰老药物也是科学工作者的不断追求。海洋生物是本世纪人们研究开发的重要药物资源。海洋蕴藏着地球上80％以上的生物物种，为了适应其变化多端的生存环境(如高压、高渗、低温等)，优胜劣汰的竞争使海洋生物形成了特殊的身体结构和奇妙的生理功能，为人类提供了许多具有新颖的化学结构和独特的生理功能的活性物质及其基因。这些活性物质可以广泛地应用于包括抗肿瘤与抗病毒药物、心血管药物以及抗衰老药物等。我国近年来虽然在海洋药物的开发方面取得了一定的成果，但主要还是停留在用化学方法提取活性物质上。生化提取的方法难以得到可以药用的单体，对于药用的单体也因为不能得到氨基酸的全序列而无法成为新药进行报批。另外，生化提取需要消耗大量的海洋资源，而有些资源不能重复收集，难以实现大规模生产；同时，也不利于实施海洋生物资源可持续性开发利用的发展战略。而利用基因工程技术，直接从基因入手，开展生物基因组研究，将有效解决这一制约因素。同时，还可以保存珍稀海洋生物的基因资源。
在新技术的推动下，国际上对功能基因组的研究已全面展开，通过“定位克隆”和“定位候选克隆”等技术发现了一大批重要人类疾病的致病基因和相关基因。相比之下，对于占地球生物80％以上种类的海洋生物的基因组研究尤其是功能基因组研究却还没有系统展开。据不完全统计。目前在GenBank数据库上已登记的核酸序列中，海洋生物占的比例不足5％。
原索动物仅存在于海洋中，是海洋中特有的动物，它包括头索动物(文昌鱼)和尾索动物(海鞘)两个亚门。其中，头索动物文昌鱼虽然在世界各大海区都有分布，但分布范围仅限于极少数很小地区。相比之下，我国青岛和厦门等地文昌鱼不但数量较多，而且世界著名。文昌鱼富含碘、不饱和脂肪酸和氨基酸，美味可口，曾经是我国福建沿海居民非常喜欢的佳肴。但是，近年来，由于环境污染和变迁，文昌鱼种群正在减少，已被我国列为国家二级保护动物。
据认为文昌鱼是动物界唯一不生长寄生虫的动物。因此我们推测文昌鱼体内可能含有特有的有价值的基因资源，通过寻找这些基因可为获得有应用前景的基因工程产品奠定基础。新近，我们从文昌鱼中克隆到了铁蛋白(ferritin)基因。人体内的铁和铁蛋白有机结合在一起，能被人体直接吸收和利用，不仅大大提高了人体对铁的吸收和利用，还避免了不被人体吸收的铁对人体的毒副作用。更重要的是，铁蛋白能促进胎儿智力、体力、免疫力、神经系统和整体器官的生长发育，还能自然地调节血液营养成份，增强血液携氧能力，提高人体运动机能和耐久力，消除疲劳、减少乳酸的形成、减少抽筋，增强竞技能力；同时，它还能消除血液中的毒素，提高血液质量，增强体质和抗病能力，提高智力和记忆力、抗衰老、美化肌肤。
为此，本发明目的是克隆文昌鱼铁蛋白基因，测定其基因序列，为获得基因工程产品奠定基础。
本发明从海洋特有原索动物文昌鱼肠提取总RNA，构建cDNA文库，大规模克隆测序后运用生物信息学技术鉴定文昌鱼铁蛋白EST片段，进而获取其全长，分析测定基因的全序列，研究其特性。
1.总RNA的获取成体青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtaunese)采集于青岛沙子口附近的海域。将文昌鱼饲养于灭菌的过滤海水中，三天之内不投喂任何饵料，使之排空消化道内的食物。在解剖镜下小心地分离出文昌鱼的消化道，用含有100mM NaCl的50mM Tris-HCl(pH 7.0)漂洗三次，然后用液氮速冻，保存于液氮内。用TRIZOL试剂(GIBCO-BRL)一步法提取文昌鱼消化道总RNA。
2.cDNA的合成运用SMARTTMcDNA合成技术合成文昌鱼肠cDNA。该技术利用真核生物mRNA 5’端的甲基化G(m7G)和5’-5’三磷酸键连接的特殊帽子结构以及3’端的PolyA尾的特点设计锚定引物，进行第一链的合成，可起到富集全长cDNA的作用。然后用LD PCR法扩增第二链cDNA。蛋白酶K消化后，再用Sfi I酶消化，然后用SMARTTM文库构建试剂盒提供的CHROMA SPIN-400分离不同大小的dscDNA。
3.载体质粒pcDNA3-SfiI的构建
pcDNA3-Sfi I载体由哺乳动物细胞高效表达载体质粒pcDNA3载体改造而来，在EcoR I和Not I酶切位点之间插入了Sfi I的酶切位点(见附图2)。具体方法为PEG纯化法提取pcDNA3.0质粒，经限制性内切酶EcoRI和NotI作用后，进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收上述酶切载体DNA。为引入SfiI酶切位点，以λTripIEx2为模板，用SMARTTMKit中测序引物扩增后，PCR产物经EcoRI和NotI酶切，T4 DNA Ligase连接经EcoRI和NotI酶切的pcDNA3.0载体DNA和PCR产物构建成pcDNA3-SfiI质粒。提取pcDNA3-SfiI用SfiI酶切后，胶回收；重复SfiI酶切和回收操作各一次，载体DNA以50ng/nl的浓度保存备用。
4.dscDNA与载体的连接5.大肠杆菌超级感受态的制备将大肠杆菌E.coli DH5α涂布于不含抗生素的LB培养基上，37℃过夜。挑取2-3个E.coli DH5α大菌落接种于50ml SOC培养基中，在250ml三角瓶中18℃摇至A600＝0.6，摇速200-250rpm，约需36-48小时；将三角瓶置于冰浴10min，将菌液移至50ml离心管中，2500g，10min，4℃；菌体用16ml冰预冷的TB溶液重悬，置于冰浴10min；2500g，10min，4℃离心；菌体用4ml冰预冷TB重悬，加280μl DMSO；菌液于冰裕10min后，分装到冻存管，每管200μl，液氮冷却，约半小时后，保存于-40℃。48hr内使用转化效率不变，用于cDNA文库的构建。
6.用制备的感受态细胞转化大肠杆菌，然后筛选文昌鱼肠cDNA文库阳性克隆并用PCR进行检测，PCR反应的引物为测序通用引物T7(5′-TAATACGACTCACTATAGGGA-3′)和SP6(5′-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3′)。
7.克隆的序列测定与分析我们应用SMARTTMcDNA Library Construction技术构建的海洋生物文昌鱼的cDNA文库，与其它cDNA文库构建方法比较，本研究方法具有只需微量的RNA样品，可直接从总RNA出发合成cDNA及通过LD PCR方法富集全长cDNA片段等优点；同时，还可通过常规电泳对每一步骤进行实时监测。因此特别适合于珍贵稀少的海洋生物组织材料的cDNA文库的构建。另外，在cDNA过柱时，收集分子量较大的前几管用来连接；虽然文库重组子总数有所下降，但可提高全长cDNA克隆比例，减少筛选的工作量，不失为一个文库构建的质量优化方法。
本发明对阳性克隆用ABI PRISM 377XL DNA测序仪进行双向测序。正向引物为T7引物，反向引物为SP6引物。序列用DNATOOL软件进行初步的编码可能性分析，然后经NCBI BLAST程序与已知的核酸序列进行初步的比较，寻找同源基因的存在。我们得到了两个编码铁蛋白(ferritin)的全长cDNA，我们认为其中一个是另一个的突变体，分别以F1(附图3)和F2(附图4)表示。F1基因长为1038bp，它的3’非翻译区长达403bp，在poly A序列上游有1个加尾信号序列AATAAA；F1 cDNA阅读编码框编码172个氨基酸残基，氨基酸序列分析表明，F1蛋白与哺乳动物牛铁蛋白以及螨虫铁蛋白高度同源(76％)。同时，通过PIRPattern Match(http//www-nbrf.georgetown.edu/pirwww/search/patmatch.html)对PROSITE database的搜索结果表明，文昌鱼F1蛋白的氨基酸序列中存在ferritin iron-binding regions signature 1，位置为59-77(EEREHAEKLMKYQNMRGGR)，这说明了F1 cDNA编码一个新的铁蛋白基因。F1和F2的显著差别在于F2的C末端少了38个氨基酸残基，故F2 cDNA长为970bp，阅读编码框只编码134个氨基酸残基。
本发明优点文昌鱼是海洋中的珍稀原索动物，据认为是动物界唯一不生长寄生虫的动物，因此从文昌鱼中可望开发具有抗菌、抗氧化的基因工程新产品。本发明克隆得到文昌鱼铁蛋白基因并测定其序列，为今后开发研制基因工程产品创造了良好的条件。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述
图1总RNA变性胶电泳2载体pcDNA3-SfiI的构建图3F1基因的核苷酸序列及对应的氨基酸序列；图4F2基因的核苷酸序列及对应的氨基酸序列；图5F1与F2蛋白的氨基酸序列Alignment比较结果。
实施例1文昌鱼cDNA文库的构建1.总RNA的提取用TRIZOL试剂(GIBCO-BRL)提取文昌鱼消化道总RNA。提取总RNA过程中的所有器皿均用DEPC处理并经过高压灭菌处理。
(1)按50-100mg文昌鱼组织/每毫升TRIZOL试剂的比例，将肠组织加入TRIZOL试剂，在低温下用匀浆器进行匀浆。
(2)于4℃12000g离心10分钟，取上清，弃去不溶解的组织碎片。
(3)于室温下静置温育5分钟，以促进核蛋白复合体的解离。按每毫升TRIZOL试剂加入0.2毫升氯仿的比例加入氯仿，室温下剧烈摇动15秒，室温温育3分钟。于4℃12000g离心15分钟。离心后，混合物分为三相下层红色的氯仿相，上层无色的水相以及中间相。
(4)小心将上层无色的水相转移到另一个离心管中，按每毫升TRIZOL试剂加入0.5ml异丙醇的比例，加入异丙醇。于室温温育10分钟。于4℃12000g离心10分钟。
(5)弃上清，加入1ml 75％乙醇，用涡旋振荡器振荡混匀。于4℃7500g离心5分钟，弃上清。
(6)室温风干RNA沉淀，用不含RNA酶的灭菌水(DEPC处理的)溶解RNA，55-60℃温育10分钟。电泳检测(见图1)。
2.pcDNA3-SfiI载体的构建pcDNA3-Sfi I载体由哺乳动物细胞高效表达载体质粒pcDNA3载体改造而来。在EcoR I和Not I酶切位点之间插入了Sfi I的酶切位点。具体为PEG纯化法提取pcDNA3.0质粒，经限制性内切酶EcoRI和NotI作用后，进行琼脂糖凝胶电泳。按OMAGA BIOTEK公司的GEL EXTRACTION KIT说明书操作，胶回收上述酶切载体DNA。为引入SfiI酶切位点，以λTripIEx2为模板，用SMARTTMKit中测序引物扩增后，PCR产物经EcoRI和NotI酶切，T4 DNA Ligase连接经EcoRI和NotI酶切的pcDNA3.0载体DNA和PCR产物构建成pcDNA3-SfiI质粒。提取pcDNA3-SfiI用SfiI酶切后，胶回收同上；重复SfiI酶切和回收操作各一次，载体DNA以50ng/nl的浓度保存备用。(见图2)。
3.文昌鱼肠cDNA文库阳性克隆的筛选挑取单克隆，接种于两只含有0.5ml LB(Amp+)培养基的Eppendorf管中，37℃，225rpm培养过夜。在其中一管菌液中加入等体积灭菌的50％甘油，于-20℃保存；另一管用于PCR检测。具体为PCR反应的引物为测序通用引物T7(5′-TAATACGACTCACTAT AGGGA-3′)和SP6(5′-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3′)。
PCR反应体系灭菌去离子水 20.4μlTaq酶Buffer(10×) 2.5μldNTP(10mM each)0.25μlBSA(购自Promega公司，100×)0.25μl引物T7(40μM) 0.25μl引物SP6(40μM) 0.25μl模板(文昌鱼胚胎mRNA反转录产物) 1.0μlTaqDNA聚合酶(Promega公司产品，2.5U/μl)0.5μl总反应体积 25μlPCR反应条件预变性95℃，2分钟，循环1次。
变性94℃，40秒；退火58℃，30秒；延伸72℃，2分钟；保温72℃，10分钟。
PCR反应结束后，电泳检查PCR产物的大小。
实施例2文昌鱼铁蛋白基因鉴定本发明通过对海洋原索动物文昌鱼肠cDNA文库的克隆测序，得到了两个编码铁蛋白(ferritin)的全长cDNA(分别以F1和F2表示)，我们认为其中一个是另一个的突变体。F1基因长为1038bp，它的3’非翻译区长达403bp，在poly A序列上游有1个加尾信号序列AATAAA；F1 cDNA阅读编码框编码172个氨基酸残基，氨基酸序列分析表明，F1蛋白与牛铁蛋白以及螨虫铁蛋白高度同源(76％)。同时，通过PIR Pattern Match(http//www-nbrf.georgetown.edu/pirwww/search/patmatch.html)对PROSITE database的搜索结果表明，文昌鱼F1蛋白的氨基酸序列中存在ferritin iron-binding regions signature 1，位置为59-77(EEREHAEKLMKYQNMRGGR)，这说明了Fl cDNA编码一个新的铁蛋白基因。F1和F2的显著差别在于F2的C末端少了38个氨基酸残基，故F2 cDNA长为970bp，阅读编码框只编码134个氨基酸残基；不过，它们之间除了其C末端几个氨基酸残基有差异外，其它的序列则完全一致。F1基因的核苷酸序列及对应的氨基酸序列见图3；F2基因的核苷酸序列及对应的氨基酸序列见图4；图5示F1与F2蛋白的氨基酸序列Alignment比较结果。
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权利要求
1.一种编码海洋原索动物文昌鱼铁蛋白的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸具有如SEQ ID No.1所示的序列。
2.由权利要求1所述的核苷酸所编码的文昌鱼铁蛋白。
3.权利要求2所述的文昌鱼铁蛋白，所述蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的文昌鱼铁蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸具有如SEQ IDNo.3所示天然基因突变体的DNA核苷酸序列。
5.由权利要求4所述的天然基因突变体核苷酸所编码的文昌鱼铁蛋白。
6.权利要求5所述的文昌鱼铁蛋白，所述蛋白具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
7.以pcDNA3载体为基础构建的pcDNA3-SfiI表达载体，其特征在于在多克隆位点区插入了一段序列，该序列具有SfiI酶切位点。
全文摘要
从海洋特有原索动物文昌鱼中克隆得到抗衰老相关的铁蛋白新基因。本发明描述了该新基因的全长cDNA序列及功能蛋白质。从文昌鱼成体肠中抽提总RNA，应用SMART
文档编号C12N15/63GK1818062SQ20051000726
公开日2006年8月16日 申请日期2005年2月7日 优先权日2005年2月7日
发明者梁惠, 张士璀, 刘振辉, 李红岩, 郭华荣 申请人:梁惠, 张士璀, 刘振辉