专利名称：一种elp融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种ELP融合蛋白及其应用。
背景技术：
随着大规模测序技术发展和广泛应用，人类基因组计划及其他物种包括海 胆、斑马鱼、文昌鱼等基因组计划也相继完成。对这些物种的基因组测序的直 接结果是产生成千上万个基因，对这些基因功能的阐明，有助于我们了解物种 在进化过程的位置；对导致疾病的基因的研究有助于了解发病机理，寻找治疗 的乾点，开发治疗相应治疗药物；同时，大量的药物蛋白基因也有待我们去研 究其生理活性，及作用靶点，为开发新型的治疗药物提供基础。基因功能研究 的方法很多，包括基因敲除技术，蛋白组学的研究，RNA干扰等。其中一个最 直接的研究方法是把所研究的基因进行重组表达，获得相应的蛋白后进行生理 和生化活性的研究和对其进行结构生物学的分析从而阐明其功能。由于物种基 因的差异性，并不是所有的基因都能成功地表达。基因不表达，蛋白表达量低 或表达的蛋白不稳定形成不可溶的包涵体，这些现象在异源表达系统中经常出 现，特别在原核表达系统中表达真核生物基因。随着DNA重组技术的发展，可 以将目的基因与表达亲和标签的基因进行融合，然后克隆在表达载体中进行融 合表达，这些亲和标签不但可以帮助所融合的目的蛋白折叠，提高目的蛋白的 可溶性和表达量，同时亲和标签能与相应的亲和层析的树脂结合，起到一步纯 化融合蛋白的作用。常用的亲和纯化标签包括谷胱甘肽-S-转移酶 (Glutathione-S-Transfemse， GST),麦芽糖结合蛋白(Maltose-binding Protein, MBP)， His标签等。最后利用蛋白酶对含有相应蛋白酶酶切位点的融合蛋白进 行切割，使目的蛋白与亲和标签蛋白分离开，通过进一步的层析分离除去亲和标签和蛋白酶而获得目的蛋白。
亲和层析是一种非常有效的分离方法，在不需要了解所融合蛋白的物化性 质的情况，就可以实现一步纯化融合蛋白,这种纯化技术被广泛应用。但是，应 用亲和层析分离技术需要昂贵的亲和树脂，和相应的纯化设备，这样限制了同
时表达多种蛋白用于高通量的结构生物学研究和高通量的药物蛋白筛选。1999 年，报道了一个热敏感的纯化标签弹性蛋白样多肽(Elastin Like Polypeptides, ELP)，这个标签起源于弹性蛋白的重复的五肽"Val-Pro-Gly-Val-Gly"。 ELP可以 经历一个可逆相变过程，称为反温度相变(Inverse Temperature Transition)。当 温度低于相变温度(Transition temperature, Tt)时，ELP在液相表J见出高度可;容， 然而当温度高于Tt时，亲水的ELP则会脱水而发生凝集，而且ELP融合蛋白 也具有这种特性，但是需要指出的是发生相变的时候只是ELP发生凝结而所融 合的外源蛋白并没有发生变性或沉淀。利用ELP的这种特性，可以方便和快速 地利用ELP标签来纯化ELP融合蛋白，而且纯化过程中不需要层析分离而避免 了昂贵的亲和树脂和纯化设备，同时ELP融合蛋白的浓缩和更换緩冲液也变得 非常简单。通过加热或提高盐离子浓度触发ELP融合蛋白的凝集，通过离心使 ELP融合蛋白于表达宿主蛋白中分离出来，用低盐低温的溶液使沉淀的ELP融 合蛋白重新溶解，再进行离心除去不可溶的蛋白而获得ELP融合蛋白，通过重 复触发沉淀、离心和重溶步骤可以获得更纯的ELP融合蛋白，这种纯化过程称 之为逆相循环(Inverse Transition Cycling, ITC )。
酶是高效、专一性强的生物催化剂。生物体内的各种化学反应都是在酶催 化下进行的，但是自由酶在水溶液中很不稳定，可溶性酶一般只能一次性地起 催化作用，同时，酶是蛋白质对热、高离子浓度、强酸、强碱及部分有机溶剂 等均不够稳定，容易失活而降低其催化能力，这些不足大大限制了酶促反应的 广泛应用。上世纪60年4<出现的固定4b酶才支术(Immobilized enzyme technology) 克服了自由酶的上迷不足，并且酶可以回收及重复使用，从而成为生物技术中 最为活跃的研究领域之一。酶(细胞)的固定化方法可大致分为吸附法、共4介偶联 法、交联法和包埋法等4种。吸附法是指通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用而达到酶固定化的方法，根据吸附剂的特点又可分为物理吸附和离子交换吸附。该法具有操作简便、条件温和及吸附剂可反复使用等优点，但也存在吸附力弱，易在不适pH、高盐浓度、高底物浓度及高温条件下解吸脱落的缺点。共价偶联法是将酶的活性非必须侧链基团与载体的功能基通过共价键结合，故表现出良好的稳定性，有利于酶的连续使用，是目前应用和研究最为活跃的一类酶固定化方法，但共价偶联反应容易使酶变性而失活。交联法是利用双功能或多功能基团试剂在酶分子之间交联架桥固定化酶的方法，其更易使酶失活。包埋法包括网格包埋、微嚢型包埋和脂质体包埋等，包埋法中因酶本身不参与化学结合反应，故可获得较高的酶活力回收，其缺点是不适用于高分子量底物的传质和用于柱反应系统，且常有扩散限制等问题。而且固定化酶费用太高，大分子的底物不易使用。上述各种固定化酶的方法所表现出的不足之处限制了其广泛应用。
发明内容
基于上述理论的基础上，本发明的一个目的是提供一种无标签的重组蛋白
的表达纯化的方法，包括如下步骤
(1 )连接目标蛋白基因与含有ELP的融合伴侣的基因成为融合蛋白基因，并表达得到融合蛋白A，其中所述融合蛋白A在所述ELP与所述含有ELP的融合伴侣的连接处至少有 一个蛋白酶酶切位点；
(2 )将步骤(1 )得到的融合蛋白A与一种含有ELP的融合蛋白酶B混合，所述的融合蛋白酶B能作用于融合蛋白A的酶切位点，但不作用于自身；
(3) 让步骤(2)的混合物相互作用，其中融合蛋白酶B将融合蛋白A降解成为含ELP的融合伴侣和目标蛋白；
(4) 改变步骤(3)的混合溶液的温度、盐离子浓度或pH中的至少一个条件，待出现聚集体后，离心，取上清溶液即为纯化的目标蛋白。
上述的ELP的单体的核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。
上述的ELP为ELP单体的四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。
上述的融合蛋白酶B包括ELP-3C或ELP-SUMO (small ubiquitin-relatedmodifier)蛋白酶
本发明的第二个目的在于提供一种无标签的重组蛋白，其是通过以下方法得到的
(1 )连接目标蛋白基因与含有ELP的融合伴侣的基因成为融合蛋白基因，并表达得到融合蛋白C，其中所述融合蛋白C在所述ELP与所述含有ELP的融合伴侣的连接处至少有一个蛋白酶酶切位点；
(2 )将步骤(1 )得到的融合蛋白C与 一种含有ELP的融合蛋白酶D混合，所述的融合蛋白酶D能作用于融合蛋白C的酶切位点，但不作用于自身；
(3) 让步骤(2)的混合物相互作用，其中融合蛋白酶D将融合蛋白C降解成为含ELP的融合伴侣和目标蛋白；
(4) 改变步骤(3)的混合溶液的温度、盐离子浓度或pH中的至少一个条件，待出现聚集体后，离心，取上清溶液即为纯化的目标蛋白。
ELP的融合伴侣是指在融合蛋白中，除了目标蛋白之外，含ELP的蛋白。上述的ELP的单体的核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。上述的ELP为ELP单体的四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。
上述融合蛋白酶D包括ELP-3C或ELP-SUMO (small ubiquitin-relatedmodifier)蛋白酶。
本发明的第三个目的在于提供一种含ELP的融合蛋白，所述融合蛋白包括弹性蛋白样多肽(ELP)和至少一种目的蛋白或多肽，所迷目的蛋白或多肽能以与ELP形成的融合蛋白的形式进行表达，所述融合蛋白能在不同的温度、不同的盐离子浓度或不同的pH值中的至少一个不同的条件下处于溶解或沉淀状态，并且所述融合蛋白能通过调节温度、盐离子浓度或pH值得以纯化。上述的弹性蛋白样多肽的单体的核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。上述的弹性蛋白样多肽包括单体的四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。
本发明的第四个目的在于提供一种表达纯化含ELP的融合蛋白的方法，包括如下步骤
(1 )连接目标蛋白基因与含有ELP的融合伴侣的基因成为融合蛋白基因，并表达得到融合蛋白E;
(2 )改变步骤(1 )得到的融合蛋白E所处的温度、盐离子浓度或pH值中的至少一个条件，待出现聚集体后，离心，所得聚体体即为含ELP的融合蛋白。所述的ELP的单体的核苷酸序列如SEQ IDNO.l所示。所述的ELP为ELP单体的四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。
所述融合蛋白酶E包括ELP-3C或ELP-SUMO (small ubiquitin-relatedmodifier)蛋白酶。
本发明的第五个目的在于提供一种用于蛋白表达纯化的试剂盒，所述试剂盒包括含ELP的质粒，所述含ELP的质粒用于制备融合蛋白F和融合蛋白G,所述融合蛋白G含有目标蛋白或多肽，所述融合蛋白F能将所述融合蛋白G通过酶切，得到目标蛋白或多肽。
所述融合蛋白F包括ELP-3C或ELP-SUMO (small ubiquitin-related modifier)蛋白酶。
所述融合蛋白F能将所述融合蛋白G酶切为ELP和目标蛋白。本发明的第六个目的在于，提供一种具有固定化酶特性的可循环利用的酶，
所述酶为包含ELP的融合蛋白酶，所述ELP能根据温度或盐离子浓度处于溶解
或沉淀状态。
所述的ELP的单体的核苷酸序列如SEQ IDNO.l所示。所述的ELP为ELP单体的四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。
所述融合蛋白酶包括ELP-3C或ELP-SUMO (small ubiquitin-related modifier)
蛋白酶。本发明的第七个目的在于提供一种利用包含ELP的蛋白酶进行循环酶切纯
化的方法，包括如下步骤
(1)将融合蛋白与底物混合，进行酶切反应；
(2 )调整酶切反应后的溶液的温度或盐离子浓度，待出现聚集体后离心； (3)将离心后得到的聚集体加入酶解液，待其溶解后，加入底物，进行 酶切反应，重复步骤(2)。
所述步骤(1)中的底物是含目标蛋白的ELP融合蛋白。
人工合成的ELP的单体是五肽"Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，， ( Xaa是除了 pro氨基酸 的任意氨基酸)，在本发明中，ELP包含了ELP单体的四聚体、五聚体、六聚体、 七聚体、八聚体、九聚体等各种类型，改变ELP或含ELP的融合蛋白所处的条件， 包括温度、盐离子浓度、pH值中的至少任一种条件，ELP或含ELP的融合蛋白能 出现沉淀或溶解的不同状态，且回复原来的条件时，ELP或含ELP的融合蛋白又 能回复到原来的状态。
在本发明中，具体是在本发明中所述的表达纯化的目的蛋白的方法、无标 签的重组蛋白、利用包含ELP的蛋白酶进行循环酶切纯化中所涉及的目的蛋白 包括了较为广泛的蛋白，具体包括病毒蛋白、细菌蛋白、酵母的表达蛋白，哺 乳动物的蛋白等等。
本发明中ELP-3C和ELP-SUMO只是两个特例，当然不限制于这两种，只 要具有酶切活性的酶蛋白都包含在本发明的范围之内。这些具有酶切活性的蛋 白酶能作用于含相应酶切位点的含ELP的融合蛋白上，从而将其底物切割为目的 蛋白和ELP融合伴侣；并且这些酶切融合蛋白不能作用于自身。所述ELP融合伴 侣是指含ELP的除了目标蛋白之外的蛋白，ELP融合伴侣与目标蛋白之间有酶切 位点，能被酶切为目标蛋白和ELP融合伴侣。
本发明中所涉及到的表达载体具有一般意义，即是指含有启动子顺序，能 有效地促使插入的目基因进行转录，进而翻译出该插入基因编码的蛋白产物的 载体。表达载体的启动子通常与其受体同源，如以大肠杆菌为受体的表达载体, 其启动子来源于大肠杆菌系统，在痘苗病毒中表达的启动子则来源于痘苗病毒。载体主要是质粒也可以是病毒，包括植物病毒、动物病毒、噬菌体，常用
的有以大肠杆菌为宿主的质粒载体，如pQE、 pMAL、 pUC等以及入噬菌体和 大肠杆菌人工染色体(BAC),以酵母菌为宿主的酵母菌人工染色体(YAC)和 pRS系列酵母质粒载体，以哺乳动物细胞(动物/大肠杆菌穿4炎质粒)为宿主的 pcDNA系列质粒和pEGFP系列质粒。
原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体具有以下几种元件选择标志 的编码序列、可控转录的启动子、转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)、 一个多限制酶切位点接头和宿主体内自主复制的序列。pET系统是在E.coli中克 隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬 菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶 诱导。该系统的在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。 用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，可避免因目的蛋白对宿主细胞的 可能毒性造成的质粒不稳定。如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方 法启动目的蛋白的表达用带有受入pL和pl启动子控制的T7RNA聚合酶的 入CE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5控制的T7 RNA聚合 酶基因的表达型细胞。在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG来 启动表达。两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同 构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。
病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作 用使外源基因进入到细胞内。本发明中所用到的载体包括常用的病毒载体，包 括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆 状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视，这是因为它与其它 病毒载体相比有特有优势，如可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒；可感染多种 哺乳动物细胞，但在细胞内无复制能力，生物安全度高；可插入高达38kb的外 源基因等。
其中最常用的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifomica)多核型多角体病毒 (multiple nuclear polyhedro-sis virus, MNPV), 筒称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科Baculoviridae的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能 感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。AcNPV病毒用作外源 基因的表达载体，通常是通过体内同源重组的方法，用外源基因替代多角体蛋 白基因而构建重组病毒。由于多角体基因启动子在感染后18 24h开始转录和翻 译， 一直持续到70h。外源基因置换掉多角体基因后，并不影响后代病毒的感染 与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒的功能。其它作为表达载体的杆状病 毒，主要是来自家蚕的NP (bombyxmoil， BmNP )。由于家蚕幼虫体内系统适 合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，具有良好的应用前景。
在酵母表达系统中，毕赤酵母表达系统被认为是最有效的表达系统之一。 毕赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效 分泌表达。胞外表达需要在外源蛋白的N末端加上一段信号肽序列，引导重组蛋 白进入分泌途径。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明利用ELP所具有的反温度相变的特性，提供了 一系列的ELP融合蛋 白，该类融合蛋白可以应用在蛋白表达及其纯化中以及具有固定化酶特性的可 循环利用的酶，解决了蛋白表达量低或形成不可溶包含体的问题，而且在蛋白 纯化中不需要利用复杂的纯化操作。将ELP融合蛋白具有固相酶的特性，便于生 产连续化、自动化，以实现工业化大规^莫生产。
图1为ELP-3C蛋白酶的诱导表达与纯化及其应用于纯化GST蛋白的 SDS-PAGE电泳图。M:蛋白质分子量标准；1: ELP-3C蛋白酶诱导表达的总菌 蛋白；2: ELP-3C蛋白酶诱导表达的裂解上清；3:加盐沉淀ELP-3C蛋白酶后 的离心上清；4:纯化后的ELP-3C蛋白酶；5:纯化后的GST-ELP; 6: ELP-3C 蛋白酶酶切GST-ELP; 7:沉淀酶切产物；8:纯化的GST。
图2为ELP-3C蛋白酶酶切GST-ELP融合蛋白的最佳酶切浓度摸索的 SDS-PAGE电泳图。1: GST-ELP; 2: ELP-3C蛋白酶GST-ELP = 1 : 10(w/w);3: ELP-3C蛋白酶GST-ELP= 1 : 50 (w/w); 4: ELP-3C蛋白酶GST-ELP = 1 : 100 (w/w); 5: ELP-3C蛋白酶GST-ELP = 1 : 500 (w/w); 6: ELP-3C蛋 白酶GST-ELP = 1 : 1000 ( w/w ); 7: ELP-3C蛋白酶GST-ELP = 1 : 5000 (w/w); 8: ELP-3C蛋白酶GST-ELP = 1 : 10000 (w/w)。
图3为利用ELP-3C蛋白酶纯化GFP蛋白的SDS-PAGE电泳图。M:蛋白 质分子量标准；1: ELP-GFP诱导表达的总菌蛋白；2: ELP-GFP诱导表达的裂 解上清；3:加盐沉淀ELP-GFP后的离心上清；4:纯化后的ELP-GFP; 5: ELP-3C 蛋白酶酶切ELP-GFP; 6:沉淀酶切产物；7:纯化的GFP。
图4为荧光显微镜下检测所纯化的GFP蛋白。
图5为利用ELP-3C蛋白酶纯化MBP蛋白的SDS-PAGE电泳图。M:蛋白 质分子量标准；1: ELP-MBP诱导表达的总菌蛋白；2: ELP-MBP诱导表达的 裂解上清；3:加盐沉淀ELP-MBP后的离心上清；4:纯化后的ELP-MBP; 5: ELP-3C蛋白酶酶切ELP-MBP; 6:沉淀酶切产物；7:纯化的MBP。
图6为利用ELP-3C蛋白酶纯化TRX蛋白的SDS-PAGE电泳图。M:蛋白 质分子量标准；1: ELP-TRX诱导表达的总菌蛋白；2: ELP-TRX诱导表达的裂 解上清；3:加盐沉淀ELP-TRX后的离心上清；4:纯化后的ELP-TRX; 5: ELP-3C 蛋白酶酶切ELP-TRX; 6:沉淀酶切产物；7:纯化的TRX。
图7为连续酶切纯化的GFP蛋白的SDS-PAGE电泳图。1:第一次ELP-3C 蛋白酶酶切ELP-GFP后纯化的GFP; 2:第二次ELP-3C蛋白酶酶切ELP-GFP 后纯化的GFP; 3:第三次ELP-3C蛋白酶酶切ELP-GFP后纯化的GFP; 4:第 四次ELP-3C蛋白酶酶切ELP-GFP后纯化的GFP; 5:第五次ELP-3C蛋白酶酶 切ELP-GFP后纯化的GFP; 6:第六次ELP-3 C蛋白酶酶切ELP-GFP后纯化的 GFP。
具体实施方式
下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如
Sambrook等分子克隆实施室手册中所述的条件。 实施例1:
用于蛋白表达纯化的试剂盒中的pET23a-ELP质粒的制备 用于蛋白表达纯化的试剂盒中的ELP-3C蛋白酶的制备 ELP-3C蛋白酶表达载体的构建及转换宿主菌
根据1999年Meyer和Chilkoti等人报道的方法合成ELP基因(Meyer, D.E., and Chilkoti, A. 1999. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nat Biotechnol 17: 1112-1115.), 其斗亥苦酉^f^歹l！ 如SEQ ID NO.l所示。通过ELP基因N端的Ecorl和C端的HindIII酶切后， 克隆于商业化原核表达载体pET23a中的相应酶切位点而形成pET23a-ELP载 体。将pET23a-ELP质粒转化入大肠杆菌DH5a菌林，经培养表达后提取 pET23a-ELP质粒。同时，根据在NCBI中的genbank上公布的人鼻病毒3C蛋 白酶的基因序列(登录号M12168)合成3C蛋白酶基因，其核苷S踏列如SEQ ID N0.2所示，并克隆于pbluscript载体中而形成pbluscript-3C载体。将 pbluscript-3C质粒转化入大肠杆菌DH5a菌抹，经培养表达后提取pbluscript-3C 质粒。应用3C蛋白酶基因N端的HindIII和C端的Notl两种内切酶对 pbluscript-3C进行酶切，将纯化获得3C基因片段克隆于pET23a-ELP载体相应 酶切位点中，使3C蛋白酶基因位于ELP基因的C端，而获得ELP-3C蛋白酶表 达载体pET23a-ELP-3C。
将构建的表达载体pET23a-ELP-3C,参照Sambrook ( Sambrook, etal.1989， Molecular doing. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA )方法，用CaCl2的 方法将质粒转化入E.co".BL21 (DE3)菌抹，用含氨千青霉素(100jig/mL)的 LB培养基培养转化菌林。
实施例2:重组ELP-3C蛋白酶的表达与纯化
将含有重组质粒pET23a-ELP-3C的表达宿主菌BL21 ( DE3 )单菌落接种于 Amp+的LB液体加富培养基中，37°C 225rpm培养12小时，作为种子菌。取种子菌按l : 100体积比接种于新鲜的Amp+TB培养基中，37"C剧烈振荡放大培 养至O.D. 600约为1.0时，将温度调到18。C培养24小时。将100ml诸导后的菌 液进行离心收菌，5000rpm 5分钟。用8ml水冷的PBS重悬菌体，然后进行超 声裂解菌体，功率为200W，超声15分钟。将裂解菌液在4。C 12000g离心10 分钟，去除不溶的菌体蛋白。将固体NaCl加入离心上清液中，并使之溶解，溶 液浓度为2M，裂解上清液在室温条件下由澄清变为浑浊。将变浑浊的裂解上清 液室温高速离心5分钟后，去除上清液。加入预冷的PBS重悬沉淀，将沉淀吹 打散，并置于冰上直至所有沉淀均溶解为止。将此蛋白溶液在4。C 12000g离心 5分钟，去除不溶的沉淀。将离心所得的上清液重复加盐使蛋白凝集，离心，溶 解蛋白沉淀，离心去除不溶沉淀的步骤，直至去除所有的杂蛋白获得较纯的目 的蛋白为止(见图1)。
实施例3:利用ELP-3C蛋白酶纯化GST蛋白
将含有重组质粒的pGEX-ELP表达宿主菌BL21( DE3 )单菌落4妻种于Amp+ 的LB液体加富培养基中，37°C 225rpm培养12小时，作为种子菌。取种子菌 按l : 100体积比接种于新鲜的Amp+LB加富培养基中，37。C剧烈振荡放大培 养至O.D. 600约为1.0时，加入0.5mM IPTG, 37。C诱导表达4小时。收菌后进 行裂解，通过加入固体NaCl使溶液浓度为2M,触发GST-ELP凝集并离心使其 沉淀，使用3C酶切緩冲液(50mMTris ,150mMNaCl， lmM EDTA， pH8.0 ， lmMDTT)进行溶解。按l : 100加入ELP-3C蛋白酶，5。C酶切16小时。酶切 后加入固体NaCl使溶液浓度为2M,触发ELP和ELP-3C蛋白酶凝集并离心除 去。收集上清液为纯化的GST蛋白(见图l)。
实施例4: ELP-3C蛋白酶酶切GST-ELP融合蛋白的最适酶切浓度
酶切100jigGST-ELP蛋白底物，按ELP-3C : GST-ELP质量比1 : 10,1 : 50,
i : ioo, i : :500, i : iooo, i : 5000, i : 10000加入ELP-3c蛋白酶，混匀后
于5。C酶切16小时。酶切反应结束后进4亍SDS-PAGE电泳4企测(见图2 )。 实施例5:利用ELP-3C蛋白酶纯化GFP蛋白
将含有重组质粒pET23a-ELP-GFP的表达宿主菌BL21 ( DE3 )单菌落接种于Amp+的LB液体加富培养基中，37°C 225rpm培养12小时，作为种子菌。 取种子菌按l : 100体积比接种于新鲜的Amp+TB培养基中，37。C剧烈振荡放 大培养至O.D. 600约为1.0时，将温度调到18。C培养24小时。收菌后进行裂解， 通过加入固体NaCH吏溶液浓度为2M，触发ELP-GFP凝集并离心使其沉淀，使 用3C酶切緩冲液(50mMTris,150mMNaCl， lmMEDTA， pH8.0 ， lmMDTT) 进行溶解。按l : 100加入ELP-3C蛋白酶，5"C酶切16小时。酶切后加入固体 NaCl使溶液浓度为2M，触发ELP和ELP-3C蛋白酶凝集并离心除去。收集上 清液为纯化的GFP蛋白(见图3)。将纯化的GFP蛋白置荧光显微镜下观察，可 以检测到明显的荧光(见图4)。
实施例6:利用ELP-3C蛋白酶纯化MBP蛋白
将含有重组质粒pET23a-ELP-MBP的表达宿主菌BL21 ( DE3 )单菌落接种 于Amp+的LB液体加富培养基中，37°C 225rpm培养12小时，作为种子菌。 取种子菌按1 : 100体积比接种于新鲜的Amp+ TB培养基中，37。C剧烈振荡放 大培养至O.D. 600约为1.0时，将温度调到18。C培养24小时。收菌后进行裂解， 通过加入固体NaCl使溶液浓度为2M,触发ELP-MBP凝集并离心使其沉淀， 使用3C酶切緩冲液(50mM Tris , 150mM NaCl, lmM EDTA, pH8. 0 ， 1mM DTT ) 进行溶解。按1 : 100加入ELP-3C蛋白酶，5。C酶切16小时。酶切后加入固体 NaCl使溶液浓度为2M,触发ELP和ELP-3C蛋白酶凝集并离心除去。收集上 清液为纯化的MBP蛋白(见图5 )。
实施例7:利用ELP-3C蛋白酶纯化TRX蛋白
将含有重组质粒pET23a-ELP-TRX的表达宿主菌BL21 ( DE3 )单菌落接种 于Amp+的LB液体加富培养基中，37°C 225rpm培养12小时，作为种子菌。 取种子菌按l : 100体积比接种于新鲜的Amp+TB培养基中，37。C剧烈振荡放 大培养至O.D. 600约为1.0时，将温度调到18。C培养24小时。收菌后进行裂解， 通过加入固体NaCl使溶液浓度为2M,触发使GST-GFP凝集并离心使其沉淀， 使用3C酶切緩冲液(50mM Tris ， 150mM NaCl, lmM EDTA， pH8. 0 ， lmM DTT ) 进行溶解。按1 : 100加入ELP-3C蛋白酶，5。C酶切16小时。酶切后加入固体NaCl使溶液浓度为2M,触发ELP和ELP-3C蛋白酶凝集并离心除去。收集上 清液为纯化的TRX蛋白(见图6)。
实施例8: ELP-3C蛋白酶重复利用活性的检测
酶切lmgELP-GFP蛋白，按ELP-3C : ELP-GFP质量比1 : 100加入ELP-3C 蛋白酶。2(TC酶切4小时后，加入固体NaCl使酶切溶液浓度为2M，室温高速 离心5分钟，保留上清样品。沉淀用含有lmg的ELP-GFP蛋白的酶切緩冲溶液 (50mM Tris , 150mM NaCl, lmM EDTA， pH8. 0 , lraM DTT )重悬，并不断地吹 吸使沉淀溶解为止，后继续进行20。C酶切4小时。如此重复上面的步骤6次。 将每次纯化的GFP蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳4全测(见图7 )。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发 明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普 通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不 脱离本发明技术方案的实质和范围。序 列 表
<110〉中山大学
<120> —种ELP融合蛋白酶及其应用 <160> 3
<210> 1
<211> 150
〈212〉駆
<213〉人工序列
<220〉
<221〉
<222〉 (l).. (150)
<223> ELP基因 <400〉 1
gtgggtgt tccgggcgtg ggtgttccgg gtggcggtgt gccgggcgcs 5 0 ggtgttcctg gtgtsggtgt gccgggtgtt ggtgtgccgg gtgttggtgt 100 accaggtggc ggtgttccgg gtgcsggcgt tccgggtggc ggtgtgccgg gc 150
<210> 2
<211> 549 <212〉腿
<213>人鼻病毒(Human Rhinovirus)
<400> 2
ggacctaaca
tdtC3CC3Ct
tttgtgttst
gtgacatccg ctggttgtac
ctgagtttgc 3gt3a3ggcg tcctsctcst ttcgtgttsa gssctgsccg tggttttstt
tctgtctctg 3gttc3ctgg gctcsgccgg
tsctg3ctct
Cttt3Ct33C
18
tctgggtatt gtgacgstgt 33sctggttg ggatcgtaat tgg33ggtgt 3ct3ttctgg
3C3tc3tgsc 50
cscgstcgtg 1〇〇
tctggtasac 150
acccggaaaa 200
g3a33gttcc 25 0
cgscgcsscc 300
aggttggtcc 350ggtaactstg tgsttcgtta tgcgcssccg gggtttctct
gctggtctga tc33cctgtc t3gcsctccg
cgactacgcs sctssssctg gtcagtgtgg
gtaagatctt tggcatccat gtaggcggta
gc3C3actgs sgaagcssts ctttgtsgsg
3CC3sccgca 400
tggtgttctg 450
acggtcgtca 500
3sgcsgt33 549
<210> <211> <212> <213〉 <220> <221> <222〉 <223> <400>
3
648 PRT
人工序列
(l)..,
ELP-3C蛋白酶 3
Met Gly 1
Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val
His Pro Pro Pro Pro Pro P:co Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
Gly Val 5
Gly Ala
20 Gly Val
35
Gly Gly
50 Gly Gly
65
Gly Val 80
Gly Ala 95
Gly Val
110 Gly Val
125 Gly Gly
140 Gly Val
155 Gly Ala170 Gly Val
185 Gly Gly
200 Gly Gly
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
Val Val Val Val Val Val Val Val Val Val Val Val Val Val Val
Pro Gly
10 Pro Gly
25 Pro Gly
40
Pro Gly
55 Pro Gly
70 Pro Gly
85
Pro Gly
100 Pro Gly
115 Pro Gly
130 Pro Gly
145 Pro Gly
160 Pro Gly
175 Pro Gly
190 Pro Gly
205 Pro Gly
Val
Val
Gly
Val
Ala
Val
Gly
Gly
Val
Ala
Val
Val
Gly
Val
Ala
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
Val Pro 15
Val Pro 30
Val Pro 45
Val Pro 60
Val Pro 75
Val Pro 90
Val Pro
105 Val Pro
120 Val Pro
135 Val Pro
150 Val Pro
165 Val Pro
180 Val Pro
195 Val Pro
210 Val Pro
Gly Gly Gly Val Gly Ala Gly Val Gly Val Gly Gly Gly Val Gly Ala Gly Val Gly Gly Gly Gly Gly Val Gly Ala Gly Val Gly Val215 220 225
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly
230 235 240
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val
245 250 255
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala
260 265 270
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
275 280 285
Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly
290 295 300
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly
305 310 315
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
320 325 330
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala
335 340 345
Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
350 355 360
Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val
365 370 375
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly
380 385 390
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly G工y Gly Val Pro Gly Val
395 400 405
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala
410 415 420
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
425 430 435
Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly
440 445 450
Gly Val Pro Gly Gly Leu Lys Leu Leu Gin Val Asp Ser Arg Gly
455 460 465
Ser Gly Pro Asn Thr Glu Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Lys Asn
470 475 480
lie Met Thr工le Thr Thr Ser Lys Gly Glu Phe Thr Gly Leu Gly
485 490 495
工le His Asp Arg Val Cys Val lie Pro Thr His Ala Gin Pro Gly
500 505 510
Asp Asp Val Leu Val Asn Gly Gin Lys lie Arg Val Lys Asp Lys
515 520 525
Tyr Lys Leu Val Asp Pro Glu Asn lie Asn Leu Glu Leu Thr Val
530 535 540
Leu Thr Leu Asp Arg Asn Glu Lys Phe Arg Asp lie Arg Gly Phe
545 550 555
lie Ser Glu Asp Leu Glu Gly Val Asp Ala Thr Leu Val Val His
560 565 570
Ser Asn Asn Phe Thr Asn Thr lie Leu Glu Val Gly Pro Val Thr
575 580 585
Met Ala Gly Leu lie Asn Leu Ser Ser Thr Pro Thr Asn Arg Met
590 595 600
lie Arg Tyr Asp Tyr Ala Thr Lys Thr Gly Gin Cys Gly Gly Val
605 610 615Leu Cys Ala Thr Gly Lys lie Phe Gly lie His Val Gly Gly Asn 620625 630
Gly Arg Gin Gly Phe Ser Ala Gin Leu Lys Lys Gin Tyr Phe Val 635640 645
Glu Lys Gin
权利要求
1、一种无标签的重组蛋白的表达纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)连接目标蛋白基因与含有ELP的融合伴侣的基因成为融合蛋白基因，并表达得到融合蛋白A，其中所述融合蛋白A在所述ELP与所述含有ELP的融合伴侣的连接处至少有一个蛋白酶酶切位点；(2)将步骤(1)得到的融合蛋白A与一种含有ELP的融合蛋白酶B混合，所述的融合蛋白酶B能作用于融合蛋白A的酶切位点，但不作用于自身；(3)让步骤(2)的混合物相互作用，其中融合蛋白酶B将融合蛋白A降解成为含ELP的融合伴侣和目标蛋白；(4)改变步骤(3)的混合溶液的温度、盐离子浓度或pH中的至少一个条件，待出现聚集体后，离心，取上清溶液即为纯化的目标蛋白。
2、 根据权利要求1所述的无标签的重组蛋白的表达纯化的方法，其特征在 于，所述的ELP的单体的核香酸序列如SEQ TDNO.l所示。
3、 根据权利要求1所述的无标签的重组蛋白的表达纯化的方法，其特征在 于，所述的ELP为ELP单体的四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九 聚
4、 根据权利要求1所述的无标签的重组蛋白的表达纯化的方法，其特征在 于，所述融合蛋白酶B包括ELP-3C或ELP-SUMO蛋白酶。
5、 一种无标签的重组蛋白，其特征在于，其是通过以下方法得到的 (1 )连接目标蛋白基因与含有ELP的融合伴侣的基因成为融合蛋白基因， 并表达得到融合蛋白C，其中所述融合蛋白C在所述ELP与所述含有ELP的融合伴倡的连接处至少有一个蛋白酶酶切酶切位点；(2 )将步骤(1 )得到的融合蛋白C与一种含有ELP的融合蛋白酶D混合， 所述的融合蛋白酶D能作用于融合蛋白C的酶切位点，但不作用于自身；(3) 让步骤(2)的混合物相互作用，其中融合蛋白酶D将融合蛋白C降 解成为含ELP的融合伴侣和目标蛋白；(4) 改变步骤(3)的混合溶液的温度、盐离子浓度或pH中的至少一个条 件，待出现聚集体后，离心，取上清溶液即为纯化的目标蛋白。
6、 一种含ELP的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括弹性蛋白样多 肽(ELP)和至少一种目的蛋白或多肽，所述目的蛋白或多肽能以与ELP形成 的融合蛋白的形式进行表达，所述融合蛋白能在不同的温度、不同的盐离子浓 度或不同的pH值中的至少一个不同的条件下处于溶解或沉淀状态，并且所述融 合蛋白能通过调节温度、盐离子浓度或pH值得以纯化。
7、 一种表达纯化含ELP的融合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1 )连接目标蛋白基因与含有ELP的融合伴侣的基因成为融合蛋白基因，并表达得到融合蛋白E;(2 )改变步骤(1 )得到的融合蛋白E所处的温度、盐离子浓度或pH值中 的至少一个条件，待出现聚集体后，离心，所得聚集体即为含ELP的融合蛋白。
8、 一种用于蛋白表达纯化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含ELP 的质粒，所述含ELP的质粒用于制备融合蛋白F和融合蛋白G,所述融合蛋白 G含有目标蛋白或多肽，所述融合蛋白F能将所述融合蛋白G通过酶切，得到 目标蛋白或多肽。
9、 一种具有固定化酶特性的可循环利用的酶，其特征在于，所述酶为包含 ELP的融合蛋白酶，所述ELP能根据温度、盐离子浓度或pH值处于溶解或沉淀状态。
10、 一种利用包含ELP的蛋白酶进行循环酶切纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤(1 )将融合蛋白酶与底物混合，进行酶切反应；(2) 调整酶切反应后的溶液的温度、盐离子浓度或pH值，待出现聚集 体后离心；(3) 将离心后得到的聚集体加入酶解液，待其溶解后，加入底物，进行 酶切反应，重复步骤(2)。
全文摘要
本发明公开了一种含ELP的融合蛋白以及相关的一系列应用，包括一种无标签的重组蛋白的表达纯化的方法、一种无标签的重组蛋白、一种表达纯化含ELP的融合蛋白的方法、一种用于蛋白表达纯化的试剂盒、一种具有固定化酶特性的可循环利用的酶以及一种利用包含ELP的蛋白酶进行循环酶切纯化的方法，本发明利用ELP所具有的反温度相变的特性，解决了蛋白表达量低或形成不可溶包含体的问题，而且在蛋白纯化中不需要利用复杂的纯化操作。另外，将含ELP的融合蛋白作为固相酶来用，避免了固相酶的劣势，且能便于生产连续化、自动化，以实现工业化大规模生产。
文档编号C12P21/06GK101633946SQ200910141889
公开日2010年1月27日 申请日期2009年5月21日 优先权日2008年12月2日
发明者徐安龙, 磊 王, 蓝东明, 陈尚武, 黄光瑞 申请人:中山大学