专利名称：一种核苷酸序列、基于序列编码的融合蛋白、制备的结核分枝杆菌疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地是涉及一种新的核苷酸序列，该核苷酸所编码的蛋白包含结核分枝杆菌ESAT6蛋白和Ag85B蛋白的优势抗原表位,还涉及该核苷酸序列在制备结核分枝杆菌疫苗上的应用。
背景技术：
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是引起结核病的病原微生物， 广泛分布于世界各地。据估计，全球每年有800万新感染的结核患者，有200万人死亡。另外，据卫生部调查，我国目前有近半数人口(5.5亿)感染过结核菌，每年约有145万新发病例，并且每年因结核病死亡人数达13万，大大超过其它传染病死亡人数的总和。卡介苗做为目前临床上唯一使用的抗结核疫苗，迄今已使用了近100年。但在长期的使用中发现，卡介苗免疫保护作用差异很大(0% 80% )，预防成人结核病方面根本就没有效果。除此之外，卡介苗尚存在下述缺点卡介苗是全菌疫苗，可引起淋巴结肿大和化脓等异常反应；卡介苗接种干扰了纯蛋白衍生物(purified protein dervatives, PPD) 诊断结核感染的价值；卡介苗接种免疫缺陷病人可引起全身播散性致死感染以及卡介苗诱导的保护力随时间推移而降低，因此，寻找一种比卡介苗免疫保护作用更好的结核分枝杆菌疫苗迫在眉睫。研究发现,ESAT6(6kD early secretory antigenic target)是结核分枝杆菌生长早期分泌的相对分子质量为6 X IO3的蛋白，具有较强的细胞免疫活性，其可导致再感染结核分枝杆菌小鼠的记忆性免疫CD4+T细胞增殖及Y干扰素大量产生，而Y干扰素可显著活化巨噬细胞，提高巨噬细胞对胞内结核分枝杆菌的生长抑制作用和杀伤能力，因此ESAT6 蛋白可作为结核亚单位疫苗的有效成分(Brandt et al，2000)。Ag85则是结核分枝杆菌培养早期滤液中的一种分泌蛋白，具有分枝菌酸转移酶的活性，在细菌细胞壁合成晚期起关键作用，并且可与细胞表面纤连蛋白结合，在分枝菌粘附细胞的过程中起重要作用。Ag85含有三种成份，分别是Ag85A、Ag85B和Ag85C。Silver等人(1995)发现Ag85B可刺激纯蛋白衍生物实验阳性的健康人群外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)明显增殖并产生Y干扰素。因此，Ag85B蛋白也是一种制备结核疫苗的候选有效组成成分。迄今为止，有关于ESAT6基因和Ag85B基因的相关实验研究表明，利用天然结核分枝杆菌ESAT6基因和Ag85B基因构建的结核分枝杆菌疫苗免疫BALB/c小鼠能产生一定水平的体液免疫和细胞免疫，但普遍存在免疫水平较低、保护力不够等问题，究其原因可能是由于不同生物的密码子偏爱性不同，导致ESAT6天然基因和Ag85B天然基因在哺乳动物体内的蛋白表达困难而造成免疫效果不佳。本发明选择采用人偏爱密码子优化结核分枝杆菌ESAT6蛋白和Ag85B蛋白优势抗原表位所对应的核苷酸序列，以提升其表达量，进而提高其免疫原性。
发明内容
发明专利目的本发明的目的之一在于提供一种新的核苷酸序列，该核苷酸所编码的蛋白包含结核分枝杆菌ESAT6蛋白和Ag85B蛋白的优势抗原表位。本发明的另一目的在于该核苷酸序列在结核分枝杆菌疫苗上的应用，并分别制备结核分枝杆菌DNA疫苗pcDNA3. I (+) -EA和重组腺病毒疫苗pAd_EA。发明技术方案为实现上述发明目的，发明人(I)分析选择结核分枝杆菌ESAT6蛋白和Ag85B蛋白的优势抗原表位，将两者连接形成新的融合蛋白EA。(2)采用人偏爱密码子将融合蛋白 EA的氨基酸序列转换成核苷酸序列并合成。(3)将合成后的融合蛋白EA基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3. I (+)及腺病毒载体pAd。(4)将构建的pcDNA3. I (+) -EA作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠。(5)将构建的pAd-EA重组腺病毒疫苗免疫BALB/c小鼠。(6)通过间接ELISA实验及淋巴细胞增殖实验检测其免疫效果。本发明在分析选择结核分枝杆菌ESAT6蛋白和Ag85B蛋白优势抗原表位的基础上，以人偏爱密码子为依据，设计了一种全新的核甘酸序列，并证实该核苷酸序列所表达的融合蛋白在BALB/c小鼠体内具有优良的免疫原性，从而为开发结核分枝杆菌疫苗提供了一种新的核苷酸序列和思路。有益效果相对于现有的结核分枝杆菌疫苗制备方法通常采用天然基因而言，本发明基于所研发的疫苗将最终用于人体内，为提高蛋白表达量，故在保证氨基酸序列不变的前提下，以人偏爱密码子为依据，设计了一种全新的核甘酸序列，并以此作为核心序列分别构建结核分枝杆菌DNA疫苗及重组腺病毒疫苗，从而大大提高了目的蛋白的表达水平并增强其免疫效果。另外，该核苷酸序列所编码的蛋白仅包含结核分枝杆菌ESAT6蛋白和Ag85B蛋白的优势抗原表位，既将两者的优点合二为一，增强目的抗原表位对小鼠免疫系统的刺激，又排除了无关序列可能带来的干扰。
图I显示的是pcDNA3. I (+)_EA DNA疫苗免疫小鼠后，ESAT6抗体的检测结果；图2显示的是pcDNA3. I (+)_EA DNA疫苗免疫小鼠后，Ag85B抗体的检测结果；图3显示的是pAd-EA重组腺病毒疫苗免疫小鼠后，ESAT6抗体的检测结果；图4显示的是pAd-EA重组腺病毒疫苗免疫小鼠后，Ag85B抗体的检测结果；图5显示的是pcDNA3. I (+)_EA DNA疫苗免疫小鼠后，ESAT6抗原特异性淋巴细胞增殖的检测结果；图6显示的是pcDNA3. I (+)_EA DNA疫苗免疫小鼠后，Ag85B抗原特异性淋巴细胞增殖的检测结果；图7显示的是pAd-EA重组腺病毒疫苗免疫小鼠后，ESAT6抗原特异性淋巴细胞增殖的检测结果；图8显示的是pAd-EA重组腺病毒疫苗免疫小鼠后，Ag85B抗原特异性淋巴细胞增殖的检测结果。
具体实施方案本发明的目的、特征及优点将通过下面具体的实施例，并参照附图做进一步详细阐述，这些实施例仅用于说明本发明是如何实现的，而不用于限制本发明的范围。实施例I.选择ESAT6蛋白的优势抗原表位以结核分枝杆菌ESAT6蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2. O分析其氨基酸序列的亲水性及抗原性，选择优势抗原表位。并通过序列比对，保证所选择表位序列特异性高，与其它蛋白序列无明显同源性，并命名为A表位(SEQ ID No 2) 0实施例2.选择Ag85B蛋白的优势抗原表位以结核分枝杆菌Ag85B蛋白为祀抗原,利用生物软件DNAssist2. O分析其氨基酸序列的亲水性及抗原性，选择优势抗原表位。并通过序列比对，保证所选择表位序列特异性高，与其它蛋白序列无明显同源性，并命名为B表位(SEQ ID No 3) 0实施例3.确定融合蛋白EA的氨基酸序列将实施例I和实施例2中所选择得到的A、B两个优势抗原表位序列通过柔性片段 (连续四个甘氨酸)连接，得到融合蛋白氨基酸序列(SEQ ID No :1)，并将该融合蛋白命名为EA0实施例4.优化编码融合蛋白EA的核苷酸序列在保证融合蛋白EA氨基酸序列不变的前提下，采用人偏爱密码子将融合蛋白EA 的氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列(SEQ ID No :4)，并应用基因合成仪合成该核苷酸序列。序列的优化及合成工作均由杭州贤至生物科技有限公司完成，合成后的EA基因克隆于PMD19-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。实施例5. pcDNA3. I (+) -EA、pcDNA3. I (+) -ESAT6、pcDNA3. I (+) _Ag85B 重组质粒的构建I) EA基因的扩增以EA基因序列(SEQ ID No 4)为模板序列，米用生物软件Primer Premier5.0分析、设计上游引物EA-F和下游引物EA-R，并分别添加酶切位点BamHI和EcoRI后合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)，具体序列如下(其中划线部分为酶切位点)EA-F :5，-CGGGATCCGCCACCATGGCCGGCATCGAGGCC-3，EA-R :5，-CGGAATTCTTAGTTCAGCTGGGCGCCC-3，以EA-F和EA-R分别为上下游引物，以合成的EA基因为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为94 °C预变性，5分钟X I循环，(94 °C，变性30秒，56 °C，退火15秒，72 °C，延伸70 秒)X 5个循环，(940C，变性30秒，60°C，退火15秒，72°C，延伸70秒)X 25个循环，72°C， 3分钟Xl循环。PCR产物行I %琼脂糖凝胶电泳，将其切胶回收(本发明所使用的胶回收试剂盒均来自宁波中鼎生物技术有限公司)。2) pcDNA3. I (+) -EA 的构建用限制性内切酶BamHI和EcoRI (宝生物工程大连有限公司)于37°C分别双酶切 EAPCR产物和pcDNA3. I (+)载体(美国Invitrogen公司)12小时，酶切产物分别行I %琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收EA酶切产物和pcDNA3. I (+)载体。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的EA酶切产物和pcDNA3. I (+)载体按一定的比例于4°C连接12 小时后，连接产物转化DH5CI感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含氨苄青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB平板，于37°C恒温培养12小时之后，于平板上挑取单克隆菌株至含氨节青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB液体培养基,37°C恒温摇床培养12小时后,米用质粒纯化试剂盒(本发明所使用的质粒纯化试剂盒均来自于宁波中鼎生物技术有限公司) 提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组质粒，可作为结核分枝杆菌DNA 疫苗使用，并命名为pcDNA3. 1(+)-ΕΑ。pcDNA3. I (+) -ESAT6、pcDNA3. I (+) _Ag85B (其中的 ESAT6 基因和 Ag85B 基因为结核分枝杆菌天然序列)制备过程和pcDNA3. I (+)-EA类似，本领域的技术人员应该熟知，在此不再赘述。实施例6. pAd-EA、pAd_ESAT6、pAd_Ag85B重组腺病毒疫苗的构建I)重组穿梭质粒pMIDA-EA的构建用限制性内切酶BamHI和EcoRI于37°C酶切pMIDA穿梭质粒(杭州贤至生物科技有限公司)12小时，酶切产物行I %琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收。使用T4连接酶将回收的pMIDA载体和实施例5中的EA酶切产物按一定的比例于4°C连接12小时后，连接产物转化DH5ci感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB平板，于37°C恒温培养12小时之后，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB液体培养基，37 °C恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组质粒，命名为pMIDA-EA。2)重组腺病毒质粒pAd-EA的构建根据美国Invitrogen公司腺病毒操作手册,将重组穿梭质粒pMIDA-EA与腺病毒骨架质粒pAd/PL-DEST(美国Invitrogen公司)按一定的比例，在重组酶LR Clonase II (美国Invitrogen公司)作用下，于25°C体外重组反应I小时之后，重组产物转化ToplO超级感受态细胞(美国Invitrogen公司),涂布于含氨节青霉素抗性(50 μ g/mL)的LB平板上，于37°C恒温培养12小时之后，于平板上挑取单克隆菌株至含氨苄青霉素抗性(50 μ g/ mL)的LB液体培养基，37 °C恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒提取质粒，经酶切鉴定及PCR鉴定后得到正确的重组腺病毒质粒，命名为pAd-EA。3)重组腺病毒疫苗pAd-EA的构建用限制性内切酶PacI (美国新英格兰生物实验公司)于37°C单酶切I μ g重组腺病毒质粒pAd-EA 5小时并纯化回收。使用转染试剂Lipofectamine 2000(美国Invitrogen 公司)，将回收的酶切产物转染HEK 293A细胞(美国Invitrogen公司)，并于37°C，5% CO2 条件下培养。每天于显微镜下观察细胞病变反应，当细胞出现明显病变，并且大于70%的 HEK 293A细胞脱壁时，即可收集细胞并经裂解后提取、纯化重组腺病毒疫苗pAd-EA。pAd-ESAT6、pAd_Ag85B (其中的ESAT6基因和Ag85B基因为结核分枝杆菌天然序列)制备过程和PAd-EA类似，本领域的技术人员应该熟知，在此不再赘述。实施例7. pcDNA3. I (+) _EA、pcDNA3. I (+) _ESAT6、pcDNA3. I (+) _Ag85B 免疫 BALB/c 小鼠取75只5 6周龄左右的健康雌性BALB/c小鼠，随机分成pcDNA3. I (+) -EA、 pcDNA3. l(+)-ESAT6、pcDNA3. l(+)_Ag85B、pcDNA3. 1(+)四个免疫组及一个空白对照组，每组15只。免疫组以每次每只100 μ g(100 μ L体积)质粒经后腿肌肉注射免疫小鼠，空白对照组改为100 μ L生理盐水经后腿肌肉注射小鼠，在第O周和第4周免疫2次，并于第5周尾静脉负压采血后分离血清。 实施例8. pAd-EA、pAd_ESAT6、pAd_Ag85B重组腺病毒疫苗免疫BALB/c小鼠取75只将5 6周龄左右的健康雌性BALB/c小鼠，随机分成pAd-EA、pAd_ESAT6、 pAd-Ag85B、pAd四个免疫组及一个空白对照组，每组15只。免疫组以每只IO7TCID5tl/次的量经单侧胫前肌内注射免疫小鼠，空白对照组改为100 μ L生理盐水，在第O周和第4周免疫2次，并于第5周尾静脉负压采血后分离血清。实施例9.体液免疫水平的检测用ELISA间接法检测免疫小鼠血清中ESAT6蛋白特异性抗体水平，具体方法如下 将原核表达并纯化的结核分枝杆菌ESAT6蛋白(杭州贤至生物科技有限公司)以一定比例用包被液稀释，100 μ L/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司)，4°C包被12小时后用洗涤液洗涤五次并拍干；加入封闭液，180 μ L/孔，37°C封闭2小时，弃孔内液体，拍干；加待检血清及对照血清，100 μ L/孔，37°C孵育I小时后,洗涤液洗涤五次并拍干；加HRP (辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG(武汉三鹰生物技术有限公司)，100 μ L/孔，37°C孵育30 分钟后，洗涤液洗涤五次并拍干；每孔加显色液A和显色液B各50 μ L，37°C避光显色10分钟后，加终止液终止反应，50 μ L/孔，酶标仪450nm波长空白孔校零后读取OD值。以ESAT6 蛋白免疫的小鼠血清作为阳性对照，先用棋盘滴定法确定最佳的抗原包被浓度(I μ g/mL) 和血清稀释倍数(I 100稀释)。然后用建立的标准ELISA方法检测免疫组小鼠的ELISA 抗体，并采用统计学软件SPSS12. O处理实验数据，应用单因素方差分析各组之间的统计学差异，两实验组间使用非配对t检验方法分别进行分析，P值均设为O. 05。用ELISA间接法检测免疫小鼠血清中Ag85B蛋白特异性抗体水平的实验过程和 ESAT6蛋白类似，本领域的技术人员应该熟知，在此不再赘述。相关溶液配方如下包被液=Na2CO3I. 5g，NaHCO3 2. 9g，加双蒸水定容至 IOOOmL (ρΗ9· 6)。封闭液=Na2HPO4.12H20 2. 68g, NaH2PO4. 2H20 O. 39g, NaCl 8. 5g，20g 牛血清白蛋白，加双蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。洗涤液=Na2HPO4.12H20 2. 68g, NaH2PO4. 2H20 O. 39g, NaCl 8. 5g, Tween-200. 5mL, 加双蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。显色液A 200mg TMB溶于IOOmL无水乙醇,加双蒸水定容至1000mL。显色液B :柠檬酸2. lg, Na2HPO4. 12H20 71g，加双蒸水定容至1000mL。使用时ImL显色液 A+lmL 显色液 B+0. 4 μ L 30% H2O2终止液2M H2SO4, 21. 7mL浓H2SO4加双蒸水定容至1000mL。检测结果显示(见图1)，与pcDNA3. 1(+)_ESAT6相比较，利用人偏爱密码子优化后的EA基因所构建的pcDNA3. I (+) -EA DNA疫苗能更有效的刺激BALB/c小鼠体液免疫反应， 产生更高滴度的ESAT6蛋白抗体，两者差异显著(P < 0. 05)。检测结果还显示(见图2)，与pcDNA3. l(+)_Ag85B相比较，利用人偏爱密码子优化后的EA基因所构建的pcDNA3. I (+) -EA DNA疫苗能更有效的刺激BALB/c小鼠体液免疫反应，产生更高滴度的Ag85B蛋白抗体，两者差异显著(P < 0. 05)。
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检测结果还显示(见图3)，与pAd_ESAT6相比较，利用人偏爱密码子优化后的EA 基因所构建的PAd-EA重组腺病毒疫苗能更有效的刺激BALB/c小鼠体液免疫反应，产生更高滴度的ESAT6蛋白抗体，两者差异显著(P < O. 05)。检测结果还显示(见图4),与pAd_Ag85B相比较,利用人偏爱密码子优化后的EA 基因所构建的PAd-EA重组腺病毒疫苗能更有效的刺激BALB/c小鼠体液免疫反应，产生更高滴度的Ag85B蛋白抗体，两者差异显著(P < O. 05)。实施例10.细胞免疫水平的检测颈椎脱位法处死小鼠，无菌取脾，按照常规方法分离淋巴细胞，用完全RMPI-1640 培养液(含10%胎牛血清、终浓度为100U/mL的青、链霉素)制备淋巴细胞悬液，并调整细胞浓度为I X IO6个/mL。96孔细胞培养板每孔加以上淋巴细胞悬液100 μ L后，实验孔加100 μ L浓度为100 μ g/mL的结核分枝杆菌ESAT6抗原，对照孔不加ESAT6抗原，只加100 μ L完全培养液，空白孔只加完全培养液200 μ L，各设4个复孔。将细胞培养板转移至培养箱中，37°C、5% CO2 及饱和湿度条件下培养68h，取出细胞培养板，每孔加5mg/mL MTT (噻唑兰)溶液20 μ L， 微型震荡器上震荡混匀后继续培养4h。培养结束，取出细胞培养板，弃上清培养液，每孔加 DMSO ( 二甲基亚砜)100 μ L，微型震荡器上震荡混匀5min，待沉淀完全溶解，选择490nm波长，于自动酶标仪上测OD49tlnm值。以刺激指数(Stimy Lation Index, SI)判断淋巴细胞的增值效价，SI =实验组OD49tlnm均值/对照组OD49tlnm均值。采用统计学软件SPSS12. O处理实验数据，应用单因素方差分析各组之间的统计学差异，两实验组间使用非配对t检验方法分别进行分析，P值均设为O. 05。免疫小鼠Ag85B抗原特异性淋巴细胞增殖的检测过程和ESAT6抗原类似，本领域的技术人员应该熟知，在此不再赘述。检测结果显示(见图5)，与pcDNA3. 1(+)_ESAT6相比较，利用人偏爱密码子优化后的EA基因所构建的pcDNA3. I (+) -EA DNA疫苗能更有效的诱导刺激BALB/c小鼠ESAT6抗原特异性淋巴细胞增殖，两者差异显著(P < O. 05)。检测结果还显示(见图6)，与pcDNA3. l(+)_Ag85B相比较，利用人偏爱密码子优化后的EA基因所构建的pcDNA3. I (+) -EA DNA疫苗能更有效的诱导刺激BALB/c小鼠Ag85B 抗原特异性淋巴细胞增殖，两者差异显著(P < O. 05)。检测结果还显示(见图7)，与pAd_ESAT6相比较，利用人偏爱密码子优化后的EA 基因所构建的PAd-EA重组腺病毒疫苗能更有效的诱导刺激BALB/c小鼠ESAT6抗原特异性淋巴细胞增殖，两者差异显著(P < O. 05)。检测结果还显示(见图8),与pAd_Ag85B相比较,利用人偏爱密码子优化后的EA 基因所构建的PAd-EA重组腺病毒疫苗能更有效的诱导刺激BALB/c小鼠Ag85B抗原特异性淋巴细胞增殖，两者差异显著(P < O. 05)。需要理解到的是上述实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
2.一种融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No:l所示。
3.权利要求I所述的核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列可编码权利要求2所述的融合蛋白。
4.一种结核分枝杆菌疫苗,其特征在于该结核分枝杆菌疫苗通过权利要求I所述的核苷酸序列制备得到。
5.根据权利要求4所述的结核分枝杆菌疫苗的制备方法，其特征在于，制备过程包括以下步骤(a)合成权利要求I所述的核苷酸序列；(b)将权利要求I所述的核苷酸序列克隆到真核表达载体,构建结核分枝杆菌DNA疫苗 pcDNA3. I (+) -EA ；(c)将权利要求I所述的核苷酸序列克隆到腺病毒载体，构建结核分枝杆菌重组腺病毒疫苗pAd-EA。
全文摘要
本发明属于生物技术领域。本发明公开了一种新的核苷酸序列，并将其应用于结核分枝杆菌疫苗的制备。分析选择结核分枝杆菌ESAT6蛋白和Ag85B蛋白的优势抗原表位，将两者连接形成新的融合蛋白EA，采用人偏爱密码子将融合蛋白EA的氨基酸序列转换成核苷酸序列并合成。将合成后的融合蛋白EA基因分别克隆到真核表达载体及腺病毒载体，并将获取的重组真核表达载体及重组腺病毒作为疫苗免疫BALB/c小鼠，最后通过间接ELISA实验及淋巴细胞增殖实验检测其免疫效果。检测结果证实，本发明制备的结核分枝杆菌疫苗可激活小鼠免疫系统，所采用的EA基因优于ESAT6天然基因和Ag85B天然基因。
文档编号A61K39/04GK102604979SQ20111014705
公开日2012年7月25日 申请日期2011年6月2日 优先权日2011年6月2日
发明者余铭恩, 冯俊涛, 吴琼杉, 李晓照, 胡成平 申请人:杭州贤至生物科技有限公司