菘蓝松脂醇还原酶蛋白编码序列及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核苷酸序列及其应用，本发明还涉及一种蛋白质的序列，属于生 物技术领域。
【背景技术】
[0002] 菘蓝为十字花科植物，其根入药，即为常用中药板蓝根，有清热解毒，凉血利咽等 功效，应用十分广泛，主要制剂有板蓝根颗粒、板蓝根含片等，临床用于流行性感冒、流行性 乙型脑炎、流行性腮腺炎、急慢性肝炎、带状疱疹等。化学成分及药理活性研究表明落叶松 脂素是菘蓝发挥抗病毒功效的重要活性物质基础。因此，提高落叶松脂素的含量是获得抗 病毒活性高的优良菘蓝品系的关键，具有重要的应用价值。
[0003] 植物次生代谢工程是利用基因工程和分子生物学方法阐明植物次生代谢产物生 物合成的机制，了解清楚代谢途径和相关酶的信息，对控制生物合成路径的基因进行调控， 从而达到在分子水平上改造代谢途径，促进目标产物的定向合成，提高植物中特定化合物 产量的目的。经文献检索发现，位于落叶松脂素合成途径最后一个步骤的松脂醇还原酶 (PLR)对落叶松脂素的生物合成起到了非常重要的调控作用，是木脂素代谢工程的重要靶 点。因此，从菘蓝中分离获得松脂醇还原酶并利用其进行代谢调控，将打破落叶松脂素生物 合成限速瓶颈，获得落叶松脂素高产的高品质菘蓝株系。目前尚未发现与本发明所提及的 菘蓝松脂醇还原酶蛋白及应用的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种编码具有菘蓝松脂醇还原酶活性的蛋白的核苷酸序列，其特征在 于：核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0005] 另外，本发明还提供一种具有菘蓝松脂醇还原酶活性的蛋白氨基酸序列，其特征 在于：其序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0006] 另外，本发明还提供一种编码具有菘蓝松脂醇还原酶活性的蛋白的核苷酸序列在 增强植物表达菘蓝松脂醇还原酶中的应用。
[0007] 另外，本发明还具有这样的特征：采用发根农杆菌C58C1作为转化载体。
[0008] 另外，本发明还提供了一种以菘蓝总RNA为模板克隆核苷序列所需的引物，其特 征在于：
[0009] 以寡核苷酸Rl: 5' -ATGAGAGAGAATAATAGCGG-3'为正向引物，以寡核苷酸R2 : 5' -CTAGAGGAATAITTTCAAATA-3' 为反向引物。
[0010] 另外，本发明还提供了一种通过转菘蓝松脂醇还原酶编码基因提高落叶松脂素的 含量的应用。
[0011] 发明作用与效果
[0012] 本发明提供了一种具有编码具有菘蓝松脂醇还原酶活性的蛋白的核苷酸序列，以 及相应的氨基酸序列，并且提供了核苷酸序列在提高菘蓝中落叶松脂素的含量中的应用， 具有重要的实用价值。
【附图说明】
[0013] 图1是I iPLR和拟南芥PLR蛋白的比对；
[0014] 图2是IiPLR重组蛋白在大肠杆菌E. coliBL21 (DE3)中原核表达的SDS-PAGE电 泳图；
[0015] 图3是IiPLR转基因发根的分子检测图；
[0016] 图4是IiPLR转基因菘蓝发根中IiPLR表达的RT-PCR分析图；以及 [0017] 图5是IiPLR转基因菘蓝发根中落叶松脂素的含量图。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合附图描述本发明实施例的【具体实施方式】
[0019] 〈实施例一〉菘蓝松脂醇还原酶基因的克隆
[0020] 1.组织分离
[0021] 菘蓝（I. indigotica)叶片采集自第二军医大学药学院植物园，采取材料后，立即 置于液氮中冷冻保存。
[0022] 2. mRNA 的分离
[0023] 取部分组织，用研钵研碎，加入盛有加入盛有TRIzoI裂解液（TRIzol Reagents，Gibco, NY，USA)的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml 新管，抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。
[0024] 3.基因的全长克隆
[0025] 根据已报导的其它植物中松脂醇还原酶保守序列，设计简并引物，利用同源性基 因克隆原理，采用RACE方法（即通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术)，使用商品化的 Gibco BRL试剂盒。
[0026] 进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：
[0027] (1)3'-RACE
[0028] PCR(引物为 AP+TNX001)得到序列 2001TNX3(514bp)，回收，连接到 T-Easy 载体 上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记（Big-Dye，Perkin-Elm er，USA)的方 法，在ABI377测序仪（Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包（Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库（Genebank+EMBL)，知其核酸序列 及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥（Arabidopsis thaliana)的松脂醇还原酶基因 的同源性很高，故初步认为它是一个松脂醇还原酶基因。
[0029] (2) 5, -RACE
[0030] 第一轮 PCR (AAP+TNX02)
[0031] 第二轮 PCR(AUAP+TNXR03)得到 2001TNX5'（723bp)(过程同⑴）
[0032] (3)PCR 扩增 2001TNX 编码区（TNX01+R1)得到 2001TNX 编码区（770bp)(过程同 ⑴）。
[0033] BLAST的结果证明从菘蓝中新得到的基因确为一个松脂醇还原酶 基因。通过组合使用上述三个步骤，获得了候选的菘蓝松脂醇还原酶基因的 全长编码序列。在拼接得到全长（至少包含完整的开放读框）的基础上，进 一步设计引物Rl:5'-ATGAGAGAGAATAATAGCGG-3'为正向引物，寡核苷酸R2 : 5' -CTAGAGGAATATTTTCAAATA-3'为反向引物，以菘蓝总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，Rl/ R2的PCR条件为94°C、5分钟，随之以94°C、45秒；58°C、45秒；72°C、1分钟的反应过程进 行35个循环，最后在72°C下延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为 1062bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得所示的序列，见SEQ ID NO. 1 的信息。
[0034] 〈实施例二〉菘蓝IiPLR基因的序列信息与同源性分析
[0035] 蒋蓝 IiPLR 全长 cDNA 的长度为 1062bp (Genbank accessionNo. JF264893)，包括 951bp的开放阅读框（0RF)，3bp的终止密码子（tag)。该ORF编码了一个317个氨基酸的肽 链。还有一个长33bp的5'引导序列和一个长75bp的3'非翻译区。等电点（pi)为5. 64， 分子量大小约为35. 6kDa。
[0036] BLAST结果显示，如图1所示IiPLR与同科植物拟南芥PLRs具有极高的相似性， 相似度均达到80%以上(见表1)。由此可见，IiPLR基因与模式植物拟南芥松脂醇还原酶 (PLR)基因存在较高的同源性，可以认为两者在功能上也有很高相似性。
[0037] 图1是IiPLR和拟南芥PLR蛋白的比对。一致的序列用白字黑底表示，大块的相 似序列用黑字浅灰底表示，不相似的残基用黑字白底表示。比对所用的PLRs序列见表1。
[0038] 表1氨基酸比对分析中用到的PLRs序列
[0039]
【主权项】
1. 一种编码具有菘蓝松脂醇还原酶活性的蛋白的核苷酸序列，其特征在于： 所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -种具有菘蓝松脂醇还原酶活性的蛋白氨基酸序列，其特征在于： 其序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -种编码具有菘蓝松脂醇还原酶活性的蛋白的核苷酸序列在增强植物表达菘蓝松 脂醇还原酶中的应用。
4. 一种菘蓝IiPLR的成熟蛋白的转化载体，其特征在于： 采用发根农杆菌C58C1作为转化载体。
5. -种以菘蓝总RNA为模板克隆如权利要求1所述的核苷酸序列所需的引物，其特征 在于： 以寡核苷酸Rl:5' -ATGAGAGAGAATAATAGCGG-3'为正向引物，以寡核苷酸R2 : 5' -CTAGAGGAATAITITCAAATA-3' 为反向引物。
6. -种通过转菘蓝松脂醇还原酶编码基因提高落叶松脂素的含量的应用。
【专利摘要】本发明提供一种编码具有菘蓝落叶松脂素还原酶活性的蛋白的核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供一种具有菘蓝落叶松脂素还原酶活性的蛋白氨基酸序列，其特征在于：其序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了一种编码具有菘蓝落叶松脂素还原酶活性的蛋白的核苷酸序列在增强植物表达菘蓝落叶松脂素还原酶中的应用。本发明有利于在植物中高表达菘蓝落叶松脂素还原酶从而提高落叶松脂素的产量。
【IPC分类】C12N15-11, C12N15-53, C12N9-02, C12N15-82, A01H5-00
【公开号】CN104805097
【申请号】CN201410030473
【发明人】肖莹, 杨颖博, 宣洪娇, 李卿, 陈万生, 张磊
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2014年1月23日