一种催化效率提高的β-葡萄糖苷酶突变体F67Y及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种催化效率提高的β-葡萄糖苷酶突变体 F67Y及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 能源短缺是人类面临的重大问题之一。而对于纤维素的利用是解决能源危机、粮 食短缺、环境污染的重要途径。葡萄糖苷酶则是当今生物乙醇生产过程中最重要的工具 酶之一。纤维素是多个葡萄糖残基以β-1，4_糖苷链连接而成的多聚物，是地球上最丰富的 可再生的生物质资源。纤维素酶是能够将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，主要包 括内切葡聚糖酶（endo-β-Ι，4_glucanase，EC 3 · 2 · 1 · 4)、外切葡聚糖酶（exoglucanase， EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)。内切葡聚糖酶作用于纤维素 长链分子的内部将长纤维切成短纤维，外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的一端，以两个葡 萄糖残基为单位进行切割生成纤维二糖，葡萄糖苷酶切割纤维二糖及一些纤维寡糖最终 生成单个的葡萄糖分子。
[0003] β-葡萄糖苷酶可水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放β-D-葡萄糖和 相应的配基。此外，葡萄糖苷酶还能微弱水解对硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷。作为 纤维素复合酶系的重要组成之一，葡萄糖苷酶的关键作用主要体现在消除纤维二糖积累 对其上游内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性的反馈抑制作用。因此，葡萄糖苷酶的高 效水解对纤维素的彻底降解起到至关重要的作用，而葡萄糖单糖的高转化率对于生物乙醇 生产中的乙醇发酵过程极其有力。由此可见，提高β-葡萄糖苷酶在纤维素降解体系的催化 活性，对于提高纤维素降解体系转化效率及降低纤维素乙醇产业生产成本，具有巨大的商 业价值和现实意义。
[0004] 高比活、高催化效率是几乎所有工业用途对β-葡萄糖苷酶的要求，而这类β-葡萄 糖苷酶的工程菌株的获得主要通过诱变、筛选和酶分子改良获得。本发明提供高温酸性β-葡萄糖苷酶具突变体，具有更高的催化效率，提升应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供了一种高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体F67Y。
[0006] 本发明的再一目的是提供编码上述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体F67Y的基因。
[0007] 本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0009] 本发明以来源于嗜热真菌篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802的酸性β-葡萄糖苷酶为母本，采用分子生物学技术对酸性葡萄糖苷酶序列进行区域替换后表达。 [0010]根据本发明的高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体，是β-葡萄糖苷酶的催化活性通道 loop区域替换后得到的突变体，即β-葡萄糖苷酶的67位氨基酸由苯丙氨酸"F"突变为酪氨 酸"γ"
[0011] 所述高催化效率β_葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] YGFGGSGWDAAYGRAKAALNKLNQTEKVGIVTGVKWMGGPCVGNTYKPSSIDYPSLCLQDSPLGVRYANPVTAFPAG INAGATWDRSLINARGAAMGAEAKGLGVNVQLGPVAGPLGKNPNSGRIWEGFSNDPYLSGVAMEETIAGMQGSGVQA CAKHYIGNEQEHNRETISSNIDDRTLHELYVWPFMNAVKANVASVMCSYNEVNGSWSCENDALLNGLLKTELGFPGY IMSDWNAQHTTVNSANSGLDMTMPGSDFNNPPGSIYWGPNLEAAVANGSVPQSRLDDMVTRILASWYLVGQDEGYPP VAFSSWNGGKANVDVTCDHKSWRAVARDSIVLLKNDNNALPLRKPKSLAIIGQDATVNPAGPNACSDRGCDTGTLA MGWGSGTAQFPYIVGPLDAIQSQAAADGTNITTSTTDDTTAAASAAASAGTAIVFINSDSGEGYITVEGNAGDRNNL DPWHNGNELVQAVAAVNKNVIVVVHSVGPVILEAILAQPNVKAIVWPGLPGQESGNALVDVLYGSTSPSGKLPYTIA KQFSDYGTTWTTSLVDDFTEGLFIDYRHFDENNITPRYEFGYGLSYTTFKYSDLDVNVQARPGAAEGPIVPGGVKEL FDTVGTVTVTVQNSGKVAGAEVAQLYIGLPDSAPSTPPKQLRGFQKLHLAPGQREGATFELTRRDISYWDVQQQKWV VPSGTFKVYVGSSSRDIREQGSFRI
[0013] 编码高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014] TATGGCTTCGGCGGCTCTGGCTGGGACGCCGCTTATGGCAGAGCAAAGGCTGCGCTGAACAAGCTCAACCAGACCGA GAAGGTTGGTATCGTCACCGGTGTCAAGTGGATGGGCGGCCCTTGTGTTGGCAACACCTACAAGCCCAGTTCGATTG ACTACCCTTCTCTGTGTTTGCAAGACTCTCCTCTCGGGGTGCGTTACGCCAACCCTGTGACTGCCTTCCCGGCTGGT ATCAACGCCGGCGCCACATGGGATAGATCTCTCATCAACGCCCGTGGTGCGGCCATGGGCGCTGAGGCCAAGGGCCT CGGTGTGAACGTCCAGCTTGGCCCCGTCGCTGGTCCTCTCGGCAAGAATCCCAATAGTGGCAGAATCTGGGAAGGGT TCTCGAATGATCCCTATCTCAGCGGTGTTGCGATGGAGGAAACCATCGCCGGAATGCAAGGATCTGGTGTGCAGGCC TGCGCCAAGCACTATATTGGTAACGAGCAAGAGCACAACCGTGAAACCATCAGCTCCAACATCGATGACCGCACTCT GCACGAGCTCTACGTCTGGCCGTTCATGAACGCCGTCAAGGCCAACGTCGCCTCCGTCATGTGCTCGTACAACGAGG TCAATGGTTCCTGGTCCTGTGAGAATGATGCTCTTCTCAACGGTCTGTTGAAGACTGAGCTCGGATTCCCCGGATAC ATCATGAGCGATTGGAACGCGCAGCACACCACGGTCAACAGCGCCAACTCGGGTCTCGATATGACCATGCCTGGCAG TGACTTCAACAACCCTCCTGGCAGCATCTACTGGGGGCCCAACCTCGAAGCCGCCGTCGCCAATGGCTCCGTTCCGC AGTCCCGTTTGGACGACATGGTCACTCGTATCCTTGCGTCTTGGTACTTGGTTGGCCAGGATGAGGGCTACCCACCG GTCGCCTTCAGCTCCTGGAATGGCGGCAAGGCCAATGTTGACGTGACGGGCGATCACAAGAGCGTCGTCAGAGCTGT GGCTCGTGACTCTATCGTTCTTCTGAAGAACGACAATAACGCTTTGCCTCTGCGCAAGCCCAAGAGCCTCGCGATCA TCGGCCAGGATGCAACTGTCAACCCTGCCGGGCCCAACGCTTGCTCTGATCGCGGCTGCGACACCGGTACTCTCGCC ATGGGTTGGGGCAGTGGTACCGCTCAGTTCCCATACATCGTCGGCCCTCTCGATGCTATCCAGTCTCAGGCTGCCGC TGATGGCACTAACATCACCACCAGCACGACCGATGATACCACCGCGGCAGCTTCTGCAGCCGCCTCCGCCGGAACCG CCATCGTCTTCATCAACTCCGACTCTGGTGAAGGTTACATCACCGTCGAGGGCAACGCTGGTGACCGCAACAACCTC GACCCCTGGCACAACGGCAACGAGCTCGTCCAGGCCGTTGCGGCTGTGAACAAGAATGTCATTGTCGTTGTCCACAG CGTCGGTCCCGTGATCTTGGAGGCTATCCTTGCACAGCCCAACGTCAAGGCCATTGTGTGGCCCGGTCTCCCTGGAC AAGAGAGCGGCAATGCCCTGGTCGATGTTCTGTACGGCTCCACCTCCCCCAGCGGCAAGTTGCCCTATACCATTGCC AAGCAGTTCAGCGACTATGGCACCACCTGGACGACCTCCCTGGTCGATGACTTCACCGAGGGTCTGTTCATTGACTA CCGCCACTTTGACGAGAACAACATTACTCCCAGATACGAGTTCGGATACGGCTTGTCTTACACCACCTTCAAATACT CCGACCTGGACGTCAACGTCCAGGCCCGCCCCGGCGCAGCCGAAGGCCCCATCGTCCCCGGCGGCGTCAAGGAACTT TTCGACACCGTCGGCACCGTCACCGTCACCGTCCAGAACAGCGGCAAGGTTGCCGGCGCGGAAGTTGCCCAGCTGTA CATCGGCCTTCCCGACTCTGCCCCGTCGACCCCTCCCAAGCAGCTCAGAGGATTCCAGAAGTTGCACCTCGCGCCCG GCCAGAGAGAGGGCGCCACTTTCGAACTCACCCGCCGAGACATCAGCTACTGGGACGTTCAGCAGCAGAAGTGGGTT GTTCCTAGCGGTACGTTCAAGGTCTATGTTGGAAGCTCGAGCAGGGACATTAGGGAGCAGGGATCTTTCCGTATTTG A
[0015] 本发明还是提供一种制备高催化效率β-葡萄糖苷酶的方法：
[0016] 1)采用over-lap PCR的方法扩增高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因序列；
[0017] 2)将催化效率β-葡萄糖苷酶突变体序列片段克隆到表达载体pPIC 9r上，重组载 体命名 pPIC9r-A-F67Y;
[0018] 3)将突变体重组载体转化毕赤酵母GS115，诱导表达，获得突变株，优选为GS115/ A-F67Y〇
[0019] 本发明还提供了包含上述β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体，优选为pPIC9r-A-F67Y。将本发明的β-葡萄糖苷酶突变体基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之 间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方 案，优选为将葡萄糖苷酶基因插入到质粒pPIC9r上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之 间，得到重组表达质粒pP