重组甲基转移酶M.SssI在大肠杆菌系统表达和纯化的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种甲基转移酶MSss.1的表达和纯化方法，以及用该方法生产的酶活性的鉴定，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]甲基转移酶Μ.SssI是从原核微生物桑皱裙螺原体(Spiroplasma sp.)MQ1菌株分离出来的一种具有保守序列的蛋白，它在体外能够在合适的条件下作用于DNA，特异性对CpG位点的胞嘧啶脱氧核苷酸C进行甲基化，在以甲基化位点检测为目的的生物化学分析以及临床诊断中具有广泛的应用价值。
[0003]当前表观遗传学研究是生物医药领域目前最热门的领域，DNA甲基化是表观遗传学最核心的研究内容之一，其与肿瘤发生发展的密切关系所引发的科研开发、临床检验、新药研发浪潮正快速改变市场格局。DNA甲基化的检测可应用重亚硫酸盐对CpG位点进行修饰，再运用甲基特异PCR法(MSP)以及高通量检测的高分辨率溶解技术(HRM)实现定性或定量检测，这两种技术都离不开作为标准的基因组DNA全甲基化阳性对照。目前市场上基因组DNA全甲基化阳性对照产品均为国外大公司专有，价格极高，若开发国内的同类产品，甲基转移酶M.SssI是必不可少的工具。
[0004]由于M.SssI对宿主细胞DNA具有甲基化功能，对细胞正常的生理功能造成毒性，因此在普通的表达条件下极易形成包涵体，对于后续的纯化造成很大的困难。目前国内外尚没有M.SssI生产方法的专利。
[0005]通常重组蛋白的表达可通过融合表达一段不影响其活性的标签以利于之后的纯化过程。然而对于甲基转移酶M.SssI的情况，融合表达标签仍不能解决其毒性问题。本专利中我们通过大肠杆菌的分泌机制，将表达产物分泌到周质空间，并通过改变诱导条件，促进重组M.SssI的高效可溶性和快速纯化。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种集纯化标签与分泌表达为一体的表达纯化系统。
[0007]本发明提供重组甲基转移酶M.SssI的表达和纯化方法。
[0008]根据本发明的一个方面，由His、MBP、CBD等纯化标签融合目的蛋白M.SssI，进行目的蛋白的一般表达纯化过程，其示意图如图1，所述纯化过程包括以下步骤:
[0009]1.将His-M.sssl或MBP-M.sssl或CBD-M.sssl目的蛋白编码基因克隆到原核表达载体，构建表达质粒；
[0010]2.将所述表达质粒转化入大肠菌株，并进行培养表达；
[0011]3.对2.所述大肠杆菌进行超声裂解或高压匀浆，裂解菌液进行低温离心和过滤，取清液；
[0012]4.通过将所述清夜与Ni或Amylose或Chitin介质结合,融合蛋白结合到介质上，杂蛋白不结合，从而去掉大部分杂蛋白，并将初步纯化的融合蛋白洗脱；
[0013]5.融合蛋白通过超滤换为低盐buffer，进行离子交换层析，获得纯的融合蛋白产品。
[0014]根据本发明的另一个方面，由纯化标签和M.SssI的融合蛋白进行融合表达，采用不同的诱导表达系统:
[0015]6.将His-M.sssl或MBP-M.sssl或CBD-M.sssl的融合蛋白构建到不同的表达质粒，当克隆到PET载体系列如pET22b时，采用BL21 (DE3)作为表达宿主，IPTG作为诱导剂；当克隆到PBAD载体如pBAD/glllA时，采用ToplO作为表达宿主，Arabinose作为诱导剂；
[0016]7.表达质粒可带有引导蛋白分泌到周质空间的信号肽,例如pelB或gene III ；
[0017]8.对6所述大肠杆菌进行诱导时，改变温度条件，例如15°C、20°C、25°C、30°C。
[0018]9.对8所述大肠杆菌离心收集，菌体进行渗透冲击、超声破碎或高压匀浆，裂解菌液进行低温离心和过滤，取清液；
[0019]10.将9所述清夜经过合适的亲和层析进行初步纯化，产物经过超滤后过离子交换层析；
[0020]11.10的蛋白产物在37°C条件下，与I μ g λ DNA和BstUI共同孵育I小时，观察对BstUI酶切的抑制活性。
[0021]本发明使用的表达载体为pET22b或pBAD/glllA，受体菌为大肠杆菌BL21(DE3)或ToplO0商品化的大肠杆菌表达载体有几十种，市售的大肠杆菌表达宿主也有多种菌株，采用其它的大肠杆菌表达载体和表达宿主也可构建本发明类似的周质空间信号肽-纯化标签-M.SssI系统。
[0022]本发明的基因克隆技术:参照Sambrook等分子克隆手册(Sambrook,et al.1989,MolecularCloning.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用 CaC12 的方法将质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)或ToplO菌株，用含氨苄青霉素(100 μ g/mL)或卡那霉素(100 μ g/mL)的LB平板培养转化菌株。
【附图说明】
[0023]图1M.SssI融合表达分泌信号肽及纯化标签的设计。其中信号肽会在融合蛋白转运到周质空间的过程中被切除；
[0024]图2重组甲基转移酶M.SssI在大肠杆菌系统的表达和纯化流程；
[0025]图3不同诱导时间的His-M.SssI表达。A图为SDS-PAGE, B图为western。M:蛋白质分子量标准；1:诱导I小时全菌；2:诱导5小时全菌；3:诱导6小时全菌；4:诱导7小时全菌；5:诱导8小时全菌；6:诱导8小时可溶蛋白；7:诱导8小时包涵体；
[0026]图4重组M.SssI制备全甲基化阳性对照，使用TOM基因进行HRM检测的标准曲线。
【具体实施方式】
[0027]实施例1
[0028]M.Sss1-His重组酶表达载体和宿主菌的构建:
[0029]根据1990年Renbaum等人报道的从桑皱裙螺原体(Spiroplasma sp.)MQ1菌株鉴定得到的 M.SssI 的 DNA 序列(Nucleic Acids Research, 1990，18 (4): 1145-1152)，在南京金斯瑞公司进行全基因合成，并在M.SssI的C端插入6His序列(CATCACCACCACCACCAC)。将该M.Sss1-His的DNA序列通过同源重组技术克隆到pBAD/glllA质粒多克隆位点的NcoI和EcoR I之间。
[0030]将构建的表达载体pBAD/glll A~M.Sss1-His 参照 Sambrook(Sambrook, etal.1989,Molecular cloning.Cold Spring Harbor LaboratoryPress,USA),用 CaC12 的方法分别将质粒转化入ToplO，用含氨苄青霉素100 μ g/mL的LB平板培养转化菌株。
[0031]实施例2
[0032]重组甲基转移酶M.SssI的表达与纯化:
[0033]将含有重组质粒pBAD/glllA-Μ.Sss1-His的表达宿主菌单菌落接种于25mLAmp+的LB液体培养中，37°C 200rpm过夜培养，作为种子菌。取种子菌按1%体积比接种于新鲜的Amp+的LB液体培养500mL中，37°C 200rpm培养3小时，至0D600达到I左右。将温度调到20°C，并加入终浓度0.01-0.02%的Arabinose继续诱导培养8小时，从第5小时每个小时取样。将500mL诱导后的菌液进行离心收菌，用40mL20mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)重悬菌体，然后细胞用高压均质机破碎。将裂解菌液4000g离心15分钟或直接过滤，去除不溶性的菌体蛋白。含M.Sss1-His的细胞破碎清液上金属离子亲和层析柱，依次用60mM和300mM咪唑洗脱。
[0034]将咪唑洗脱下含目的蛋白的部分通过超滤，将buffer换为20mM磷酸盐缓冲液，并将蛋白浓度调整为不高于0.2mg/mL,上阳离子交换柱SP Sepharose0用A液(20mM磷酸盐缓冲液，PH6.0)和B液(20mM磷酸盐缓冲液，IM NaCl,pH6.0)洗柱子，方法为首先用100%A液冲洗3个柱体积，再在10个柱体积的范围内线性洗脱到B液100 %。收集所出的峰并进行检测，得到纯的M.SssI融合蛋白。
[0035]实施例3
[0036]用所纯化的甲基转移酶M.SssI处理人Jurkat细胞基因组DNA，方法为用IygK重组M.SssI,加入到含500ngjurkat细胞基因组DNA的体系中，37°C孵育1_4小时，将所有的CpG位点甲基化。甲基化效率经过亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP)进行检测，可选择多个基因的CpG岛，这些基因包括MGMT，F0XP3, TOMlLl等。
【主权项】
1.一种综合利用周质空间信号肽与纯化标签以表达和纯化重组甲基转移酶M.SssI的方法。详细内容包括: (1)His、MBP或CBD等纯化标签序列克隆在M.SssI的N端或C端，插入到含有pelB或geneIII信号肽的载体，构建表达质粒； (2)将所述表达质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)或ToplO，挑取克隆鉴定后进行培养; (3)在一定的诱导剂浓度、温度、时间等条件下进行诱导，使融合蛋白得到表达； (4)对上述大肠杆菌进行收集，沉淀重悬后应用渗透冲击、超声破碎或高压匀浆法破碎细胞，释放可溶性蛋白，并通过低温离心收取上清液； (5)将所述上清液先后经过亲和层析、超滤、阳离子交换层析进行纯化，得到纯的重组M.SssI融合蛋白。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述培养表达是将单菌落接种于Amp+的LB液体培养基中，370C 200rpm过夜培养，作为种子菌；取种子菌接种于新鲜的TB，2XYT，ZYM5052, LB, SOC等合适的发酵培养基37°C培养至合适菌密度后，加诱导剂ImM IPTG或0.02% Arabinose，在20°C _37°C温度下继续培养，诱导表达。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于融合蛋白前端的信号肽在转运过程中被切掉，仅余M.SssI与纯化标签的融合蛋白被分泌到大肠杆菌周质空间，降低其对宿主细胞的毒性，并以可溶形式存在。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于带有纯化标签的M.SssI融合蛋白以可溶形式存在，避开进行包涵体变性复性等复杂过程。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于带有纯化标签的M.SssI融合蛋白以可溶形式存在，有利于应用亲和层析一步即得到较高效的纯化，并结合离子交换、疏水等不同层析方式得到高纯度的产品。
【专利摘要】本发明利用通过优化大肠杆菌表达系统、诱导条件，实现重组甲基转移酶M.SssI的可溶性表达及下游纯化。通过超滤、亲和层析、阳离子交换层析等层析方法的组合，从细胞破碎液中分离纯化出目的蛋白。此过程所采用大肠杆菌表达纯化系统具有节省时间，成本低廉，对环境要求简单，不涉及具有污染性的化学品等优势，易于规模放大。
【IPC分类】C12N15/70, C12N9/10
【公开号】CN105567654
【申请号】CN201410524269
【发明人】王舒, 仇超
【申请人】上海妙聚生物科技有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月8日