一种花椒内生短杆菌及其筛选纯化方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种花椒内生短杆菌及其筛选纯化方法和用途，其特点是以新鲜花椒果实为原料，用重铬酸钾抑制真菌的生长，以此采取消毒清洗、平板富集培养、梯度稀释平板涂布、初筛、复筛等方法进行筛选和纯化。通过生理生化特征及16S?rDNA序列分析，确定该菌株为耐寒短杆菌（Brevibacterium?frigoritolerans）新亚种。本发明得到的菌株碳源选择范围广，并且其发酵代谢产物具有抗氧化性，在天然抗氧化剂的生产方面具有很好的应用前景。
【专利说明】一种花椒内生短杆菌及其筛选纯化方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种花椒内生短杆菌及其筛选纯化方法和用途。
[0002]本发明得到的菌株已于2013年9月14日中国典型培养物保藏中心保藏，编号:CCTCC M2013422,分类名称:耐寒短杆菌属 GH-HJZ2 (Brevibacterium frigoritoleransGH-HJZ2)。
【背景技术】
[0003]天然抗氧化剂应用范围广，毒副作用小，所以一直倍受人们关注，从植物中提取天然抗氧化活性物质更是众多学者一直研究的热点。随着人们对环境保护意识的增强，在不破坏植物的方式提取天然抗氧化物质已是大势所趋，植物生长环境较难模拟，生长周期长，不少植物都濒临灭绝，这些给本领域进一步研究带来了诸多困难。国内外研究证实植物内生菌是一种可开发利用的新型资源，在与宿主相互作用过程中，许多植物内生菌不仅具有促进宿主活性物质的生成和积累的能力，而且还能产生与宿主相同或相类似的活性物质。植物内生菌的次级代谢产物也非常丰富，主要包括萜类、生物碱、皂苷类、芳香类、多肽类等，这些物质大多具有生物学活性，如抗菌、抗病毒等作用，并对多种疾病具有很好的免疫效果。
[0004]目前，未见有对花椒内生菌的专利文献和非专利文献报道，也没有关于花椒内生菌代谢产物有抗氧化性的研究报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株花椒内生菌，并在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M2013422 ;本发明的另一个目的是筛选纯化方法和用途
[0006]本发明的花椒内生菌是发明人从花椒果实中分离得到的一株短杆菌，经传统方法鉴定和分子鉴定表明它属于耐寒短杆菌，将其命名为GH-HJZ2。
[0007]本发明的花椒内生菌——GH-HJZ2已于2013年9月14日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2013422。
[0008]本发明的目的由以下技术措施实现
[0009]花椒内生短杆菌及其筛选纯化方法包括以下步骤:
[0010](I)清洗消毒
[0011]在无菌操作台内，用浓度为1%_3%次氯酸钠浸泡新鲜红花椒果实3-10min，用浓度为75%的乙醇消毒10-15min，无菌水冲洗3次，并保留最后一次洗涤用水作为对照；
[0012](2)富集培养
[0013]将上述清洗消毒处理的新鲜红花椒果实，研磨，接种于含有1%重铬酸钾的营养琼脂固体培养基，于温度28~30°C恒温培养箱下培养5~7天,观察有菌落长出；
[0014](3)平板涂布
[0015]将上述营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度28~30°C恒温培养箱中培养5~7天后挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线后置于28~30°C的恒温培养箱中培养5~7天；
[0016](4)初筛:
[0017]挑选步骤(3)生长得到的单菌落，用无菌生理盐水稀释后涂布于营养琼脂固体培养基上，然后放入无菌牛津杯，每个平板可放3个牛津杯，呈等腰三角形分布于平板中，使用移液枪往牛津杯中加入200 μ L花椒精油，在温度28~30°C恒温培养箱中培养3天，根据抑菌圈直径大小，从中选择出对花椒精油不敏感的菌株；
[0018](5)复筛
[0019]将步骤(4)所得菌株接种到营养琼脂液体培养基中，在温度28~30°C摇床中发酵培养，将发酵液离心后取上清液，通过2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除实验评价发酵液抗氧化性后，将发酵液抗氧化活性最强菌株编号并保藏；
[0020](6)生理生化特征和16S rDNA分析
[0021]生理生化特征和16S rDNA分析，确定筛选菌株的种类。
[0022]结果显示:在此条件下，花椒果实表面杀菌彻底，分离得到的内生菌无杂菌干扰。
[0023]生理生化特征:如表1所示，16S rDNA分析:详见SEQUENCE LISTING。
[0024]所述富集培养基:蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，琼脂1.5%，pH为7.0~7.6，灭菌后加入1%的重铬酸钾；营养琼脂固体培养基:蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，琼脂1.5%，pH为7.0~7.6 ;营养琼脂液体培养基:蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，pH为7.0 ~7.6。
[0025]以此经过上述6个筛选步骤，筛选得到纯菌株，将所得菌株分别在光学显微镜(革兰氏染色后)以及电子显微镜下观察细菌，其形态特征:本发明菌种为革兰氏阴性菌，菌体单个短杆状，表面光滑，两端圆钝，长1.3-1.4 μ m,宽0.4 μ m。无芽孢,无鞭毛,不运动。在营养琼脂培养基上生长良好，菌落形态呈黄白色，光滑，菌落边缘不平整，不产色素，生长温度为28-30°C，菌种的生长能够利用醋酸盐、葡萄糖、蔗糖和乳糖作为唯一碳源，且生长过程中不产气，经过分子扩增测序得到该短杆菌CCTCC M2013422的16S rDNA序列与耐寒短杆菌 Brevibacterium frigoritolerans (HQ242765)分子同源性最高，达 99% 以上。
[0026]本发明的短杆菌CCTCC M2013422发酵液的抗氧化作用包括以下步骤:
[0027](I)将营养琼脂液体培养基分装于三角瓶中，用接种环挑取少许纯化后的菌种于培养瓶中，在温度28-30°C摇床培养48h，发酵液经4000r/min离心10min，取上清液，减压浓缩干燥后得花椒内生菌发酵液提取物；
[0028](2)在96孔板中加入180 μ L ABTS工作液。将花椒内生菌发酵液提取物分别以100mg/mL, 50mg/mL, 25mg/mL, 12.5mg/mL, 6.25mg/mL浓度加入 96 孔板,加入量为 20 μ L/ 孔。在避光条件下，进行自由基清除实验反应30min，反应结束后立即测定各个反应液的吸光度，并计算清除率及半抑制浓度值(IC5(I)。
[0029]本发明具有如下优点:
[0030]1、筛选方法简单，操作方便。筛选得到的花椒内生菌无杂菌干扰。
[0031]2、筛选得到的花椒内生菌GH-HJZ2为耐寒短杆菌的新亚种。
[0032]3、筛选得到的花椒内生菌菌株发酵液具有较好的抗氧化活性。【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为菌株CCTCC M2013422的扫描电镜图
[0034]图2为菌株CCTCC M2013422的扫描电镜放大图
[0035]图3为菌株CCTCC M2013422的ABTS自由基清除活性图
【具体实施方式】
[0036]下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0037]实施例1:
[0038](I)清洗消毒
[0039]在无菌操作台内，用1%次氯酸钠浸泡汉源产新鲜红花椒果实IOmin后，用75%的乙醇消毒lOmin，无菌水冲洗三次，并保留最后一次洗涤用水作为对照。
[0040](2)富集培养
[0041]将表面消毒后的花椒果实研磨后接种于营养琼脂培养基平板，于温度28°C恒温培养箱中培养7天。
[0042](3)平板涂布
[0043]从营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度28°C恒温培养箱中培养7天后挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线后置于温度28°C的恒温培养箱中培养7天。
[0044](4)初筛
[0045]挑选步骤(3)生长得到的单菌落，用无菌生理盐水稀释后涂布于营养琼脂固体培养基上，然后放入无菌牛津杯，每个平板可放3个牛津杯，呈等腰三角形分布于平板中，使用移液枪往牛津杯中加入200 μ L花椒精油，在温度28°C恒温培养箱中培养3天。根据抑菌圈直径大小，从中选择出对花椒精油不敏感的菌株；
[0046](5)复筛
[0047]将步骤(4)所得菌株接种到营养琼脂液体培养基中，在温度28°C摇床中发酵培养。将发酵液离心后取上清液，通过ABTS自由基清除实验检测其发酵液抗氧化性后，将发酵液抗氧化活性最强菌株编号并保藏。
[0048](6)生理生化特征和16S rDNA分析:
[0049]生理生化特征和16S rDNA分析，确定筛选菌株的种类。
[0050]实施例2
[0051](I)清洗消毒:
[0052]在无菌操作台内，用2%次氯酸钠浸泡汉源产新鲜红花椒果实7min后，用75%的乙醇消毒13min，无菌水冲洗三次，并保留最后一次洗涤用水作为对照。
[0053](2)富集培养:将表面消毒后的花椒果实研磨后接种于营养琼脂培养基平板，于温度29°C恒温培养箱中培养6天。
[0054](3)平板涂布:[0055]从营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度29°C恒温培养箱中培养6天后挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线后置于29°C的恒温培养箱中培养6天。
[0056](4)初筛:
[0057]挑选步骤(3)生长得到的单菌落，用无菌生理盐水稀释后涂布于营养琼脂固体培养基上，然后放入无菌牛津杯，每个平板可放3个牛津杯，呈等腰三角形分布于平板中，使用移液枪往牛津杯中加入200 μ L花椒精油，在温度29°C恒温培养箱中培养3天。根据抑菌圈直径大小，从中选择出对花椒精油不敏感的菌株；
[0058](5)复筛:
[0059]将步骤(4)所得菌株接种到营养琼脂液体培养基中，在温度29°C摇床中发酵培养。将发酵液离心后取上清液，通过ABTS自由基清除实验检测其发酵液抗氧化性后，将发酵液抗氧化活性最强菌株编号并保藏。
[0060](6)生理生化特征和16S rDNA分析:生理生化特征和16S rDNA分析，确定筛选菌株的种类。
[0061]实施例3
[0062](I)清洗消毒:
[0063]在无菌操作台内，用3%次氯酸钠浸泡汉源产新鲜红花椒果实3min后,用75%的乙醇消毒15min，无菌 水冲洗三次，并保留最后一次洗涤用水作为对照。
[0064](2)富集培养:
[0065]将表面消毒后的花椒果实研磨后接种于营养琼脂培养基平板，于温度30°C恒温培养箱中培养5天。
[0066](3)平板涂布:
[0067]从营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度30°C恒温培养箱中培养5天后挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线后置于温度30°C的恒温培养箱中培养5天。
[0068](4)初筛:
[0069]挑选步骤(3)生长得到的单菌落，用无菌生理盐水稀释后涂布于营养琼脂固体培养基上，然后放入无菌牛津杯，每个平板可放3个牛津杯，呈等腰三角形分布于平板中，使用移液枪往牛津杯中加入200 μ L花椒精油，在温度30°C恒温培养箱中培养3天。根据抑菌圈直径大小，从中选择出对花椒精油不敏感的菌株；
[0070](5)复筛:
[0071]将步骤(4)所得菌株接种到营养琼脂液体培养基中，在温度30°C摇床中发酵培养。将发酵液离心后取上清液，通过ABTS自由基清除实验检测其发酵液抗氧化性后，将发酵液抗氧化活性最强菌株编号并保藏。
[0072](6)生理生化特征和16S rDNA分析:生理生化特征和16S rDNA分析，确定筛选菌株的种类。
[0073]应用实例I
[0074]花椒内生菌发酵液的抗氧化活性检测方法之一:
[0075](I)通过实例I的分离纯化方案，将从花椒果实中分离纯化得到的内生菌菌株进行液体发酵培养:花椒内生细菌培养基为营养琼脂液体培养基，将营养琼脂液体培养基分装于三角瓶中，用接种环挑取少许纯化后的菌种于培养瓶中，在温度28~30°C摇床培养48h，发酵液经4000r/min离心10min，取上清液，减压浓缩干燥后得花椒内生菌发酵液提取物。
[0076](2)抗氧化活性测定:在96孔板中加入180 μ L ABTS工作液。将花椒内生菌发酵液提取物分别以 100mg/mL, 50mg/mL, 25mg/mL, 12.5mg/mL, 6.25mg/mL 浓度加入 96 孔板,加入量为20 μ L/孔。在避光条件下，进行自由基清除实验反应30min，反应结束后立即测定各个反应液的吸光度，并计算清除率及IC5(I。
[0077](3)抗氧化活性测定实验结果如图2所示。结果表明，当花椒内生菌发酵液浓度达到lmg/mL时，对ABTS自由基的清除率可以达到93%。经计算花椒内生菌发酵液对ABTS自由基的 IC5tl=0.2500mg/mL。
[0078]表1GH-HJZ2的生理生化特征
[0079]
【权利要求】
1.一株花椒内生菌，其特征在于:该菌是耐寒短杆菌(Brevibacteriumfrigoritolerans) CCTCC M2013422。
2.按照权利要求1所述的花椒内生菌，其特征是在于: (O形态特征:本发明菌株为革兰氏阴性菌，菌体单个短杆状，表面光滑，长1.3-1.4 μ m,宽0.4 μ m,无芽孢,无鞭毛,在营养琼脂培养基上生长良好，菌落形态呈黄白色，光滑，菌落边缘不平整； (2)生理生化特性
3.按照权利要求2所述花 椒内生菌的筛选纯化方法，其特征在于该菌是通过花椒精油筛选得到，花椒精油具有抑菌作用，能够抑制杂菌生长，筛选纯化方法的步骤如下: (1)清洗消毒 在无菌操作台内，用浓度为1%_3%次氯酸钠浸泡新鲜红花椒果实3-10min，用浓度为75%的乙醇消毒10-15min,无菌水冲洗3次,并保留最后一次洗漆用水作为对照； (2)富集培养 将上述清洗消毒处理的新鲜红花椒果实，研磨，接种于含有1%重铬酸钾的营养琼脂固体培养基，于温度28~30°C恒温培养箱中培养5~7天,观察有菌落长出； (3)平板涂布 将上述营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度28~30°C恒温培养箱中培养5~7天后挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线后置于温度28~30°C的恒温培养箱中培养5天； (4)初筛 挑选步骤(3)生长得到的单菌落，用无菌生理盐水稀释后涂布于营养琼脂固体培养基上，然后放入无菌牛津杯，每个平板可放3个牛津杯，呈等腰三角形分布于平板中，使用移液枪往牛津杯中加入200 μ L花椒精油，在温度28~30°C恒温培养箱中培养3天。根据抑菌圈直径大小，从中选择出对花椒精油不敏感的菌株； (5)复筛 将步骤(4)所得菌株接种到营养琼脂液体培养基中，在温度28~30°C摇床中发酵培养，将发酵液离心后取上清液，通过ABTS自由基清除实验评价发酵液抗氧化性后，将发酵液抗氧化活性最强菌株编号并保藏； (6)生理生化特征和16S rDNA分析 生理生化特征和16S rDNA分析，确定筛选菌株的种类。
4.按照权利要求2所述花椒内生菌的筛选纯化方法，其特征在于富集培养基:蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，琼脂1.5%，pH为7.0~7.6，灭菌后加入1%的重铬酸钾；营养琼脂固体培养基:蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，琼脂1.5%，pH为7.0~7.6 ;营养琼脂液体培养基:蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，pH为7.0~7.6。
5.根据权利要求1所述花椒内生菌的用途，其特征在于该内生菌发酵液的抗氧化作用包括以下步骤: (1)将营养琼脂液体培养基分装于三角瓶中，用接种环挑取少许纯化后的菌种于培养瓶中，于温度28-30°C摇床培养48h，发酵液经4000r/min离心10min，取上清液，减压浓缩后冷冻干燥得花椒内生菌发酵液提取物； (2)在96孔板中加入180μ L ABTS工作液，将花椒内生菌发酵液提取物分别以IOOmg/mL, 50mg/mL, 25mg/mL, 12.5mg/mL, 6.25mg/mL 的浓度加入 96 孔板,加入量为 20 μ L/ 孔,在避光条件下，进行自由基清除实验反应30min，反应结束后立即测定各个反应液的吸光度，并计算清除率及IC5(I。·
【文档编号】C12N1/20GK103849581SQ201310739690
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】钟凯, 李霄洁, 田苗, 高鸿, 山口五十磨 申请人:四川大学