一种芽孢杆菌及其筛选方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，具体公开了一种芽孢杆菌及其筛选方法和应用。本发明所述芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.8629。本发明从香草兰中筛选出一株产β-D-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌，其水解香兰素葡萄糖苷能力较强，能够形成香兰素，且不污染环境，生态、安全，能够广泛应用在香兰素的制备中。
【专利说明】一种芽孢杆菌及其筛选方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，更具体的说是涉及一种芽孢杆菌及其筛选方法和应用。【背景技术】
[0002]香草兰原产墨西哥，属兰科攀缘藤本。香草兰是高级食用香料，有“食用香料之王”之称，豆荚含有2~3%的香兰素，广泛用于食品工业中。
[0003]香草兰发酵豆荚的最主要风味物质为香兰素，其中香兰素由其前体香兰素葡萄糖苷经豆荚自身携带的内源β-D-葡萄糖苷酶水解而形成。β-D-葡萄糖苷酶属纤维素酶类，能够水解β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基，在自然界中分布非常广泛。β -D-葡萄糖苷酶参与了生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用。之前研究发现β-D-葡萄糖苷酶能将植物体内的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质，因此在食品领域具有重要使用价值。
[0004]目前，已分离到多种产β-D-葡萄糖苷酶的细菌，但是关于产β -D-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌，特别是分离自香草兰的产β -D-葡萄糖苷酶芽孢杆菌未见有报道，而且这种菌株可应用于香兰素葡萄糖苷水解形成香兰素。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌及其筛选方法和应用，使得该菌株能够水解香兰素葡萄糖 苷形成香兰素，应用于香兰素的制备中。
[0006]本发明的另一个目的在提供一种水解香兰素葡萄糖苷能力较强的芽孢杆菌。
[0007]为实现本发明目的，本发明提供一种从香草兰豆荚中分离得到的芽孢杆菌，命名为菌株ΧΥ18，菌株ΧΥ18在LB培养基上菌落呈圆形，乳白色，不透明，中间略微拱起。显微观察菌体为单胞，杆状，有时成链，有鞭毛。革兰氏染色阳性，芽孢椭圆或卵圆形。可以在含0-8%NaCl 和 ρΗ4.0-8.0 的 LB 培养基上 20-45 °C 生长。
[0008]用细菌16S rDNA通用引物A8-27f和B1523-1504r进行PCR扩增该菌株16S rDNA序列，序列长度为1403bp (序列参见SEQ ID NO:1所示核苷酸序列)。提交GenBank，登陆号为KF986320。经GenBank数据库BLAST比对，结果表明，与菌株XY18同源性高的100株菌株均是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，其同源性达99%以上。结合生理生化特征，鉴定其为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。
[0009]本发明所述芽孢杆菌已于2013年12月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.8629。
[0010]本发明所述芽孢杆菌以发酵后的香草兰豆荚为材料，进行筛选纯化，最终获得了目的菌株，步骤如下:
[0011]步骤1、取发酵完成的香草兰豆荚，置于无菌水中，充分震荡后，将混合液涂布于LB平板培养基上28°C培养，平板培养基上长出菌落后，挑取单菌落划线纯化培养获得单一菌株；
[0012]步骤2、将步骤I获得的纯化后菌株接种于含七叶苷和柠檬酸高铁氨的LB固体培养基上28°C培养，挑取平板上产生黑色水解圈的菌落，获得所述芽孢杆菌。
[0013]其中，作为优选，步骤I所述LB平板培养基pH为7.0，每升包括IOg NaCl、IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物以及15g琼脂。
[0014]作为优选，步骤2所述含七叶苷和柠檬酸高铁氨的LB固体培养基pH为7.0，每升包括IOg NaClUOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、15g琼脂、Ig七叶苷和2.5g柠檬酸高铁氨。
[0015]作为优选，步骤I所述发酵具体步骤为:
[0016]取香草兰豆荚热水70°C杀青5min，杀青后豆荚50°C热风发汗25h，然后再经室温干燥I个月，最后室温陈香半年即完成发酵处理。
[0017]将本发明所述芽孢杆菌接种到以香兰素葡萄糖苷为唯一碳源的无机盐液体培养基，香兰素葡萄糖苷浓度为255mg/L，经过20h的培养，培养基中香兰素葡萄糖苷浓度为0，被完全水解，同时培养基中检测到香兰素浓度为42.8mg/L，表明了本发明所述芽孢杆菌XY18在20h内能够将浓度为255mg/L的香兰素葡萄糖苷完全水解，并且生成了香兰素。由此本发明提供了所述芽孢杆菌在产β -D-葡萄糖苷酶、水解香兰素葡萄糖苷和/或制备香兰素中的应用。
[0018]同时，本发明还提供一种制备香兰素的方法，包括以下步骤:
[0019]配置以香兰素 葡萄糖苷为唯一碳源的无机盐液体培养基，将权利要求1所述芽孢杆菌接种于无机盐液体培养基中，28°C 170rpm摇床培养，即可获得香兰素。
[0020]其中，作为优选，所述无机盐液体培养基为ρΗ7.0包括NH4NO3L 5g/L、K2HPO4L 5g/UKH2PO40.5g/L、MgSO40.2g/L、NaCllg/L，香兰素葡萄糖苷255mg/L的无机盐液培养基。
[0021]由以上技术方案可知，本发明从香草兰中筛选出一株产β-D-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌，其水解香兰素葡萄糖苷能力较强，能够形成香兰素，且不污染环境，生态、安全，能够广泛应用在香兰素的制备中。
[0022]生物保藏说明
[0023]分类命名:芽孢杆菌，Bacillus sp.于2013年12月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.8629。
【具体实施方式】
[0024]本发明公开了一种芽孢杆菌及其筛选方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述芽孢杆菌已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0025]下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0026]实施例1:本发明所述芽孢杆菌的筛选方法
[0027]取发酵完成的香草兰豆荚0.2-0.5cm，置于无菌水IOmL中，充分震荡后，将0.2mL混合液涂布于LB平板培养基(IL:10g NaCl，IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，15g琼脂，pH为7.0)上，28°C培养24h后，固体平板上长出菌落。挑取单菌落经3次划线纯化培养，获取单—菌株。
[0028]分别将经纯化的菌株接种于含七叶苷和柠檬酸高铁氨的LB固体培养基(1L培养基:10g NaCl，1Og胰蛋白胨，5g酵母提取物，15g琼脂，Ig七叶苷，2.5g柠檬酸高铁氨，pH为
7.0)上28°C培养24h，挑取平板上产生黑色水解圈的菌落，命名为菌株XY18。
[0029]实施例2:本发明所述芽孢杆菌生理生化以及16S DNA序列的测定
[0030]1、形态及生理生化检测
[0031]检测菌株XY18在LB平板上的生长情况、菌落形态与颜色、革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色等，方法参照沈萍主编的《微生物学实验(第三版)》的方法进行。所得菌株XY18在LB培养基平板上，菌落颜色为不透明乳白色，圆形菌落边缘整齐中间略微拱起。显微观察菌体为单细胞，杆状。革兰氏染色为阳性，芽孢椭圆或卵圆形。
[0032]检测菌株XY18分别在不同温度下、不同pH值条件下、不同NaCl浓度下进行LB液体培养，培养的温度最优选择为28-35°C;培养的pH值最优选择为5.0-7.0 ;培养的NaCl最优浓度选择为1%。
[0033]采用Biolog系统对菌株XY18进行生理生化分析以及Sherlock MIDKMicrobialIdentification)系统进行脂肪酸测定,结果显示,菌株XY18可以利用龙胆二糖、木聚糖等多种碳水化合物，并且菌株细胞中主要脂肪酸为anteiso-C15:(l、iso-C15:0> anteiso-C17:(l及iso-C17l0O
[0034]2、16S rDNA序列的测定
[0035]参照细菌基因组DNA提取方法(天根生化科技有限公司DP302-02)，用细菌16SrDNA通用引物A8-27f和B1523_1504r进行PCR扩增。
[0036]25μ L 的反应体系:2.5μ L10XPCR buffer, 200 μ M dNTP (each)，80nM A8_27f，80nM B1523-1504r, 1.25U Taq polymerase (Takara, Dalian, and PRC)和 I μ L 基因组 DNA(approx.1OngX
[0037]PCR 扩增反应条件:94°C 3min ；94°C Imin，56°C Imin，72°C 2min,共 30 个循环；然后72°C保持lOmin。PCR产物委托华大基因有限公司进行直接测序(序列参见SEQ ID NO:1所示核苷酸序列)。测得的序列用BLAST软件进行序列比对分析，并与GenBank中已知的16SrDNA进行同源性比较。
[0038]检测结果如下:
[0039]将该PCR扩增产物在GenBank中(登录号:KF986320)进行BLAST比对。结果表明，与菌株XY18同源性高的100株菌株均是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，其同源性达99%以上，由此可推断菌株XY18属芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。
[0040]采用多种生物学软件对测得的序列进行分析，构建系统发育树。用于系统发育分析的其它所有菌株序列及相关资料均来自GenBank数据库。首先下载该数据库中Bacillus属与XY18亲缘关系较近的种模式菌株序列，整理成FASTA格式的文件。根据用Clustalxl.81软件进行比对的结果，对所选择出的序列长度进行整理，使用于系统发育分析的序列长度基本一致。采用MEGA5.05软件构建系统发育树。
[0041]系统发育学分析显不，菌株XY18 与 B.amy1liquefaciens NBRC15535T 和B.siamensis I3D-AIOt聚为单独的一支。16S rDNA序列同源性分析发现菌株XY18与B.amyloliquefaciens NBRC15535T 和 B.siamensis PD-AIOt 的序列相似性为 99.1% 和99.2%。
[0042]结合生理生化和16S rDNA分析结果，将菌株XY18鉴定为一株芽孢杆菌属的菌株(Bacillus sp.)。
[0043]实施例3:本发明所述芽孢杆菌水解香兰素葡萄糖苷的能力试验
[0044]配置以香兰素葡萄糖苷为唯一碳源的无机盐液体培养基(丽)=NH4NO3L 5g/L,K2HPO4L 5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO40.2g/L，NaCllg/L, pH7.0，其中香兰素葡萄糖苷浓度为255mg/L。
[0045]将芽孢杆菌XY18接种于上述培养基中，28°C 170rpm摇床培养20h后，培养基中香兰素葡萄糖苷浓度为0，被完全水解，同时培养基中检测到香兰素浓度为42.8mg/L，表明了本发明所述芽孢杆菌XY18在20h内能够将浓度为255mg/L的香兰素葡萄糖苷完全水解，并且生成了香兰素，说明了菌株XY18可应用于对香兰素葡萄糖苷的水解生成香兰素，并且水解能力较强。
[0046]实施例4:本发明所述制备香兰素的方法
[0047]配置以香兰素葡萄糖苷为唯一碳源的无机盐液体培养基(丽)=NH4NO3L 5g/L,K2HPO4L 5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO40.2g/L，NaCllg/L, pH7.0，其中香兰素葡萄糖苷浓度为255mg/L。
[0048]将芽孢杆菌XY18接种于上述培养基中，28°C 170rpm摇床培养20h后即可获得香兰素。 [0049]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其特征在于，保藏编号为CGMCC N0.8629。
2.根据权利要求1所述芽孢杆菌，其特征在于，16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1所述芽孢杆菌在产β-D-葡萄糖苷酶、水解香兰素葡萄糖苷和/或制备香兰素中的应用。
4.权利要求1所述芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1、取发酵完成的香草兰豆荚，置于无菌水中，充分震荡后，将混合液涂布于LB平板培养基上28°C培养，平板培养基上长出菌落后，挑取单菌落划线纯化培养获得单一菌株; 步骤2、将步骤I获得的纯化后菌株接种于含七叶苷和柠檬酸高铁氨的LB固体培养基上28°C培养，挑取平板上产生黑色水解圈的菌落，获得所述芽孢杆菌。
5.根据权利要求4所述筛选方法，其特征在于，步骤I所述LB平板培养基pH为7.0，每升包括IOg NaClUOg胰蛋白胨、5g酵母提取物以及15g琼脂。
6.根据权利要求4所述筛选方法，其特征在于，步骤2所述含七叶苷和柠檬酸高铁氨的LB固体培养基pH为7.0，每升包括IOg NaCl、IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、15g琼脂、Ig七叶苷和2.5g柠檬酸高铁氨。
7.根据权利要求4所述筛选方法，其特征在于，步骤I所述发酵具体步骤为: 取香草兰豆荚热水 70°C杀青5min，杀青后豆荚50°C热风发汗25h，然后再经室温干燥I个月，最后室温陈香半年即完成发酵处理。
8.一种制备香兰素的方法，其特征在于，包括以下步骤: 配置以香兰素葡萄糖苷为唯一碳源的无机盐液体培养基，将权利要求1所述芽孢杆菌接种于无机盐液体培养基中，28 °C 170rpm摇床培养，即可获得香兰素。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述无机盐液体培养基为pH7.0包括NH4NO3L 5g/L,K2HPO4L 5g/L,KH2PO40.5g/L、MgS040.2g/L、NaCllg/L，香兰素葡萄糖苷 255mg/L的无机盐液培养基。
【文档编号】C12N9/42GK103789239SQ201410040021
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】谷风林, 陈永敢, 李积华, 贺书珍, 徐飞, 房一明, 谭乐和 申请人:中国热带农业科学院香料饮料研究所