专利名称：一种利用侧芽孢杆菌生产抗菌肽的方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵领域，具体地，涉及侧芽孢杆菌发酵制备抗菌肽的工艺方法。
背景技术：
抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMP)是生物产生的一种具有抗菌活性的多肽， 一般分子量小于5kD，氨基酸数目小于100。与抗生素相比，抗菌肽安全性高，对人和动物正常细胞无害，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类生物防腐剂。它具有较广的抑菌谱，不仅能够抑制细菌，而且对真菌、病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用。此外，还具有稳定性高、耐热性好、溶解性好等特点。这些优点使其在食品工业和饲料工业中有广阔的应用前景。在食品防腐领域，目前使用最广泛的抗菌肽是由乳酸链球菌产生的乳酸链球菌肽 (Nisin)。Nisin可以被消化道中酶降解，是一种对人体无毒的天然食品防腐剂，已被广泛应用于乳制品、肉制品、罐装食品和饮料的防腐保鲜。然而Nisin也存在一些局限性，例如抑菌谱较窄，仅对亲缘关系相近的革兰氏阳性菌有显著的抑菌作用，而对革兰氏阴性菌和真菌没有活性；在中性和碱性条件下对热不稳定，从而使其在食品中的应用受到了一定限制。 作为饲料添加剂，抗菌肽具有显著的防病促生长效果，近年来受到国内外的极大关注，已成为饲用抗生素替代品的研究热点之一。例如柞蚕抗菌肽应用于预防及治疗鸡白痢效果明显；蚕抗菌肽可减轻断奶仔猪的腹泻；酵母基因工程抗菌肽可促进仔鸡生产和减少排泄物氮含量，对粤黄鸡具有促生长、保健和治疗疾病的功能。抗菌肽酵母制剂作饲料添加剂的应用效果显著，而其它大规模运用于生产实际的抗菌肽添加剂不多见。迄今为止，已在许多生物包括动物、植物及微生物中发现了 600多种内源性抗菌肽。由于植物、动物源抗菌肽的来源有限，限制了其在实际中的大规模应用，而利用微生物发酵生产抗菌肽具有明显的优势周期短、成本低、且不受季节和气候等环境因素的影响， 可实现大规模工业化生产，是克服抗菌肽实际应用技术瓶颈的有利途径。许多微生物可以产生抗菌肽，当前的研究主要集中在乳酸菌，然而乳酸菌来源的抗菌肽大多存在抗菌谱窄、 耐热性差等问题，因此，进一步开发抗菌谱更广，性能优良的抗菌肽防腐剂显得更加迫切。 芽孢杆菌和类芽孢杆菌产生的抗菌肽普遍抑菌谱广、稳定性高，开始引起国内外研究人员的注意，而对芽孢杆菌和类芽孢杆菌产生的抗菌肽报道不多。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种利用侧孢短芽饱杆菌生产抗菌肽的方法。本发明的第二个目的在于提供上述方法生产的抗菌肽在食品防腐和饲料添加剂中的应用。侧孢短芽孢杆菌，也被称为侧孢芽孢杆菌，细胞杆状，形成椭圆形芽孢，芽孢位于芽孢囊一侧，好氧，最适合生长温度为^_30°C，产生大量几丁质酶，可以抑制多种真菌。侧孢芽孢杆菌已被用来生产功能性食品和饲用微生态制剂，是食品、饲料中允许使用的微生物，具有极高的安全性，是一种潜在的益生菌。本发明提供的发酵生产抗菌肽的方法，是以侧孢短芽孢杆菌(Brevikicillus laterosporu)为菌种，接入碳源、氮源及无机盐组成的发酵培养基中，发酵制备得到抗菌肽。本发明发酵生产抗菌肽的方法，其包括步骤1)种子培养将侧孢芽孢杆菌接入灭菌后的种子培养基中，于30-37°C培养12-1 !，得到种子液，含菌量为107-108cfu/ml。种子培养基的配制如下牛肉膏0.5-lg，蛋白胨l_2g，氯化钠0.5-0. 7g，蒸馏水 100ml, pH 7. 2-7. 4 ；2)发酵培养将步骤1)得到的种子液按接种量-3%接种到发酵培养基中进行发酵培养，培养条件30-40°C，摇床转速180j80r/min，发酵培养12_24h。所述发酵培养基分别含碳源0. 5 % -3 %，氮源0. 5 % -3. 5 %，无机盐 0. 005% -0. 2%,均为质量体积比。上述步骤1)的侧孢芽孢杆菌为侧孢芽孢杆菌(Brevikicillus laterosporus) ASl.864，(Brevibacillus laterosporus)ASl. 2738,侧孢芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)ASl. 2739，侧孢芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)CICC6014 中的一种或多种。其中步骤1)所述的种子培养，其培养条件为30°C，培养12h。其中步骤1)所述的种子培养基，为牛肉膏0.5g，蛋白胨lg，氯化钠0.5g，水 100ml, pH 7. 3 ；其中步骤2)所述的发酵培养条件为32°C，摇床转速MOr/min，发酵培养18h。其中步骤2、所述的碳源包括葡萄糖、玉米淀粉糖、可溶性淀粉中的一种或几种。优选碳源为葡萄糖。其中步骤2、所述的氮源包括玉米浆、大豆粕、蛋白胨中的一种或几种。优选氮源为玉米浆。其中步骤2)所述的无机盐选用CaCl2、ZnCl2^MnCl2中的一种或几种。优选无机盐为CaCl2。本发明提供了利用侧芽饱杆菌发酵生产的抗菌肽在食品防腐或饲料添加剂中的应用。抑菌实验表明，本发明方法发酵得到的抗菌肽对常见的食源性指示菌(如金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌)有抑菌表现，具有广谱抑菌活性。将制备得到的发酵液经脱水浓缩，与辅料按1 1比例(质量比)混合，所得添加剂以2% (质量百分比)的浓度添加到浓缩饲料中，可用于动物生产中，其对包括大肠杆菌、 沙门氏菌、金黄色葡萄球菌在内的革兰氏阴性菌及其他杂菌具有很好的抑制作用。用本发明方法制得的抗菌肽进行急性攻毒试验，脏器系数、血液生理生化指标表明，在已超出试剂使用量添加到食品中，小鼠食用后，并没有对小鼠的生长、代谢、免疫功能造成损害，仍然是安全的，因此可以认定本发明方法制得的抗菌肽在使用安全，毒性级别应属于“安全无毒级”，是一种安全的制剂。本发明提供的一种利用侧孢短芽孢杆菌发酵制备抗菌肽的方法，制备工艺简单、 产率高，通过发酵的方法，12-24h发酵液中抗菌肽效价达1000-1500AU/ml。侧孢短芽孢杆菌可以在廉价发酵培养基产生高活性的抗菌肽，降低生产成本，所得抗菌肽具有广谱的抗菌活性、PH范围广、耐热性能好，可作为食品防腐剂和饲料添加剂。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。本发明实施例所用菌种为侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus Iaterosporus ASl. 864 ；Brevibaci1Ius laterosporus ASl.2738 ；Brevibaci1Ius Iaterosporus ASl. 2739 ；以上菌种均已公开，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1抗菌肽的制备1、制备种子液将侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)ASl. 2738接入灭菌后的种子培养基中，于30°C培养16h，得到种子液，含菌量为108cfu/ml。所述种子培养基的配制如下酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，pH 7. 3 ；2、发酵培养制备抗菌肽将步骤1)得到的种子液按接种量2%体积比接种到发酵培养基中进行发酵培养， 培养条件32°C，摇床转速180r/min，发酵培养18h，所述发酵培养基分别含碳源3. 5 %，氮源3 %，无机盐0.2%，均为质量体积比。实施例2抗菌肽的制备1、制备种子液将侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)ASl. 2739接入灭菌后的种子培养基中，于37°C培养12h，得到种子液，含菌量为107cfu/ml。所述种子培养基的配制如下牛肉膏10g，蛋白胨20g，氯化钠7g，蒸馏水1000ml， pH 7. 2 ；2、发酵培养制备抗菌肽将步骤1)得到的种子液按接种量2%体积比接种到发酵培养基中进行发酵培养， 培养条件35°C，摇床转速^Or/min，发酵培养16h，所述发酵培养基分别含碳源0. 5%，氮源0. 5%，无机盐0. 005%，均为质量体积比。实施例3抗菌肽的确定采用国际公认的“蛋白酶敏感法”，将实施例1和实施例2获得的发酵液分别进行如下处理1、IOOOOrpm离心15min去除菌体得到上清液，然后经0. 22 μ m滤膜过滤除确保去除菌体；2、将上清液pH调至6. 5以排除有机酸的作用；3、取等量样液，分别与lOmg/mL的蛋白酶(胃蛋白酶、蛋白酶E、胰蛋白酶、蛋白酶K)溶液1 1体积混合， 在37°C恒温水浴锅中反应池，反应结束后100°C沸水浴中煮沸灭酶5min ；4、分别取蛋白酶处理前后的样品，用琼脂扩散法测定抑菌圈直径，并进行比较。结果如表1所示，结果表明 实施例1和实施例2获得抑菌物质对蛋白酶E和胃蛋白酶敏感，抑菌圈直径分别减小至8. O 和14. Omm，特别是经蛋白酶E处理后抑菌活性完全损失，这表明该物质为抗菌肽。表1抗菌肽的确定
im>m>m>mmmmmimimimieammma>>>m>m>mimmimimif!TX!TX!TX!T^>>>">>>">>>"mmimimK::.:::.:::.:::.mnmmmimimimmtimimiim............WMwmwMttMtMtMmaMiMiMiMtMtMmMsawMWMWwwwwwwwBmBmBmBmttMtMtMtwaMaMaMaaiMwwwMwmwmBmBmttMtMmMmimim!
_对照蛋白酶K 蛋白酶E 胃蛋白酶胰蛋白酶抑菌圏直径 17.016.88.014.016.8
(mm)
^maaasaaasaaaoasmememmmmmmmmmememtmmmm.............................................................................................................................................................................................................................................................................................賊賊銷实施例4不同碳源对抗菌肽效价的影响制得3份发酵培养基，其为分别在蒸馏水中按质量百分比中添加，葡萄糖1%、 糊精和可溶性淀粉1%，另外每份发酵培养基中添加玉米浆1.0%，CaCl2 0.05%，对 Brevibacillus laterosporus ASl. 864进行发酵实验，发酵IMi后对发酵液进行检测，结果如表2所示，葡萄糖作为碳源抗菌肽的效价较高，不同碳源对抗菌肽的生成有较为显著的区别。抗菌肽的效价测定采用国际上公认的“二倍稀释法”，将抗菌肽依次进行2倍稀释，抗菌肽的效价定义为2n(AU/ml)，η表示指示菌的最大稀释度的倒数。表2不同碳源对抗菌肽效价的影响
葡萄糖可溶性淀粉糊精-
抗菌肽(AU/ml)800-1000800-900300-400实施例5不同氮源对抗菌肽效价的影响制得3份发酵培养基，其为分别在蒸馏水中按质量百分比中添加，蛋白胨1%、 玉米浆和大豆粕1%，另外每份发酵培养基中添加玉米浆1.0%，CaCl2 0.05%，对 Brevibacillus laterosporus ASl. 864进行发酵实验，发酵IMi后对发酵液进行检测，抗菌肽的效价测定采用国际上公认的“二倍稀释法”，将抗菌肽依次进行2倍稀释，抗菌肽的效价定义为2n(AU/ml)，η表示指示菌的最大稀释度的倒数。结果如表3所示，玉米浆作为碳源抗菌肽的效价较高，不同氮源对抗菌肽的生成有较为显著的区别。表3不同氮源对抗菌肽效价的影响
wsmsmsma......................................................................................................igg&gg&gg&aa^^^^gg&gg&gg&aaaBaaaBaaaBawwftmftmwa&ggagg&gsfwmwmwmoggoggogg&gs&gs&gs&gs&as&as&asiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiKWMWMWMWwwftmwa&gg&gg&ggfeggfeggfegg&^^^^iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiia&gg&gg&ggfeggfeggfegggMMaBaaaBaaaBaafeggfeggfegggMmogsogsogs^^^
Γ 蛋白胨玉米浆大豆粕-
抗菌肽(AU/ml)800-10001000-1500700-800实施例6不同金属离子对抗菌肽效价的影响参照实施例3和4配制培养基的方法，制得3份发酵培养基，与上述不同的是，本实施例培养基含葡萄糖1. 0%，玉米浆1. 0%，3份培养基分别添加不同金属离子0. 3%，通过检测Brevibacillus laterosporus ASl. 864发酵1 后抗菌肽的效价，抗菌肽的效价测定采用国际上公认的“二倍稀释法”，将抗菌肽依次进行2倍稀释，抗菌肽的效价定义为 2n(AU/ml)，η表示指示菌的最大稀释度的倒数。添加金属离子CaCl2抗菌肽效价最高。不同金属离子对抗菌肽效价的影响如表4所示。表4不同金属离子对抗菌肽效价的影响
权利要求
1.一种发酵生产抗菌肽的方法，是以侧孢短芽孢杆菌(Brevikicillus laterosporu) 为菌种，接入碳源、氮源及无机盐组成的发酵培养基中，发酵制备得到抗菌肽。
2.如权利要求1所述的方法，其包括步骤1)种子培养将侧孢短芽孢杆菌接入灭菌后的种子培养基中，于30-37°C培养12-1他，得到种子液， 含菌量为 107-108cfu/ml ；种子培养基的配制如下牛肉膏0. 5-lg，蛋白胨l-2g，氯化钠0. 5-0. 7g，蒸馏水100ml， pH 7. 2-7. 4 ；2)发酵培养将步骤1)得到的种子液按接种量-3%接种到发酵培养基中进行发酵培养，培养条件30-40°C，摇床转速 180480r/min，发酵培养 12_24h，所述发酵培养基分别含碳源0.5% -3%，氮源0.5% -3. 5%，无机盐0. 005% -0.2%, 均为质量体积比。
3.如权利要求2所述的方法，其中步骤1)所述的侧孢短芽孢杆菌为侧孢芽孢杆菌 (Brevibacillus laterosporus)ASl. 864, (Brevibacillus laterosporus)AS 1.2738,侧孢芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)AS 1· 2739，侧孢芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus) CICC6014 中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的方法，其中步骤1)所述的种子培养，其培养条件为30°C，培养12h。
5.如权利要求2所述的方法，其中步骤1)所述的种子培养基，为牛肉膏0.5g，蛋白胨 lg，氯化钠 0. 5g，水 100ml, pH 7. 3。
6.如权利要求2所述的方法，其中步骤幻所述的发酵培养条件为32°C，摇床转速 M0r/min，发酵培养18h。
7.如权利要求2所述的方法，其中步骤幻所述的碳源为葡萄糖、玉米淀粉糖、可溶性淀粉中的一种或几种。
8.如权利要求2所述的方法，其中步骤2)所述的氮源为玉米浆、大豆粕、蛋白胨中的一种或几种。
9.如权利要求2所述的方法，其中步骤2)所述的无机盐选用CaCl2、&iCl2、MnCl2中的一种或几种。
10.权利要求1-9所述方法生产的抗菌肽在食品防腐或饲料添加剂中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种生产抗菌肽的方法，是以侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)为菌种，接入添加碳源、氮源及无机盐组成的发酵培养基中，30-40℃摇床培养12-24小时，得到效价1000-1500AU/ml的抗菌肽，该抗菌肽抗菌谱广、安全性好、稳定性高。本发明提供的生产抗菌肽的方法及其产品具有成本低、制备工艺简单、产率高、抗菌谱广、杀菌效力高等优点，可广泛地应用于食品、水果及蔬菜保鲜防腐及饲料添加剂等领域。
文档编号A23J3/20GK102524518SQ20121001995
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月21日 优先权日2012年1月21日
发明者孙继良, 李兴峰, 王广贤, 王志新, 田丰伟, 贾英民, 陈卫 申请人:河北科技大学