专利名称：一种小单孢菌菌株、制备方法及其应用的制作方法
一种小单孢菌菌株、制备方法及其应用技术领域：
本发明涉及一种小单孢菌菌株，该小单孢菌菌株的制备方法，及该小单孢菌菌株的应用。
背景技术：
小单孢菌属(Micromonospora)属于放线菌目小单孢菌科(Micromonosporaceae),因菌丝上着生单个孢子而得名，该属菌为革兰氏阳性菌，不抗酸，好氧或微好气，化能异养菌，基内菌丝发达，分枝有隔。在基内菌丝上长单个孢子，有梗或无梗，孢子不游动。小单孢菌是抗生素的重要来源。临床上应用的许多氨基糖抗生素如庆大霉素等都是小单孢菌产生的。目前从该属发现的抗生素种 类仅次于链霉菌，达450种以上。1987年从Caliche 土壤样品中分离的棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora subsp. calichensis产生结构新颖的烯二块类抗肿瘤抗生素CalicheamicinYltj该化合物细胞毒性高，至少是多柔比星的1000倍。该药物的第一个抗体靶向化疗药物CMA-676 (Mylotarg) 以在临床应用，它可治疗严重、快速发展的致命性疾病急性骨髓性白血病(acute myeloid leukaemia)。从斐济海鞘(Polysyncratonlithostrotum)中分离到小单抱菌Micromonospora Iomaiviticins,它产生抗肿瘤和细胞毒的抗生素Lomaiviticins即Lomaiviticins A和B (重氮苯并荷葡萄糖苷对称二聚体)。Lomaiviticins 是很强的破坏 DNA 的药物,BIA〈0. lng/spot。Lomaiviticins A 对许多肿瘤细胞株作用强，IC50为0. 01-98ng/ml，细胞毒作用方式与已知DNA损害剂多柔比星、丝裂霉素不同。它还具有很强的抗金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的作用，MIC为6-25ng/spot,已进入I期临床实验。综上所述，在小单孢菌中已发现了一些具有重要商业价值的次级代谢产物，它们是新生素和其他生物活性物质的重要微生物来源。
发明内容本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种小单孢菌菌株。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之一的一种小单孢菌菌株，所述菌株为小单孢菌菌株 FM07-0019 (Mciromonospora sp. FM07-0019)，于 2012 年 8 月 23 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6474。本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种所述的小单孢菌菌株的分离方法，充分利用中国的海洋药物资源，简单易行。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之二的一种所述的小单孢菌菌株的分离方法，包括以下步骤步骤100 :将2克采集于智利南部43° 32 ^ (V S，72° 52f Of W，水深20米的海底海泥用无菌陈海水稀释成KT1和10_2倍；步骤200 :分别取原液及稀释过的样品悬液0. ImL涂布于燕麦琼脂培养基进行菌种分离，并于30°C下培养2周，得到小单孢菌菌FM07-0019。
进一步地，所述燕麦琼脂培养基组分为燕麦粉2%、琼脂2%、重铬酸钾50mg/L、微量元素溶液0. lml/100ml,其余成分为水,且所述水包括质量比为I : I的蒸懼水和海水；所述微量元素溶液包括如下组分=FeSO4 7H200. lg, MnCl2 4H20 0. lg, ZnSO4 7H20 0. lg,蒸锻水IOOOmlo本发明所要解决的技术问题之三在于提供一种所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，通过提取分离该新菌株的发酵液获得了一种能够抑制肿瘤的大环内脂类化合物。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之三的一种所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，包括以下步骤(I)制备小单孢菌菌株FM07-0019发酵液将一钼环小单孢菌菌株FM07-0019的燕麦琼脂斜面培养物接入种子培养基，于温度35°C，转速220rpm/min下培养48h ;然后按10%的移种量转入发酵培养基，并于温度28°C，转速220rpm/min下振荡培养96 120h ； (2)提取将⑴中获得的小单孢菌菌株FM07-0019发酵液于4500rpm离心15min以获得上清液和菌丝体；所述菌丝体用2倍于菌丝体体积的甲醇浸泡，经减压浓缩后再用水稀释；将稀释液与上清液合并后一起流经大孔吸附树脂Hp-20，再用甲醇洗出并浓缩，最后浓缩物用等体积的乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得浸膏状提取物；(3)分离将⑵中获得的提取物采用正相硅胶柱层析，用体积比100 0，98 2，95 5，90 10，80 20，70 30，50 50，0 100 的氯仿-甲醇溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，并收集Rf值为0.6的馏份；再经S印hadex LH-20凝胶柱层析，用体积比I: I的甲醇-氯仿洗脱，薄层层析检测，并收集Rf值为0. 6的馏份；再经C18反相柱层析，以甲醇-水梯度洗脱，流速为lml/min，且所述甲醇-水梯度为甲醇含量在30min内从0到100% ;薄层层析检测，并收集Rf值为0. 6的馏份；再将馏份经制备型高压液相色谱进行分离，以60%乙腈溶液洗脱，流速为I. 5ml/min，得到大环内脂类化合物。进一步地，所述薄层层析的展层剂为体积比9:1氯仿-甲醇溶剂。进一步地，所述种子培养基的组分为可溶性淀粉I. 5%，葡萄糖0. 5%，蛋白胨0. 5%酵母粉 0. 5%MgS04 7H20 0. 05%, NaCl 0. 05%, (NH4) 2S040 . 05%, K2HPO4O. 05%, CaCO3O. 1%，蒸馏水配制，pH为7. 5 ;且所述种子培养基中各组分的百分数均为质量分数。进一步地，所述发酵培养基的组分为可溶性淀粉4%葡萄糖0. 5%，蛋白胨0. 5%花生饼粉 2. 0%MgS04 7H20 0. 05%, K2HPO4O. 05%, CaCO3O. 1%，蒸馏水配制，pH 为 7. 5，且所述发酵培养基中各组分的百分数均为质量分数。本发明所要解决的技术问题之四在于提供一种所述的小单孢菌菌株制备的大环内脂类化合物，其具有很强的抗肿瘤活性。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之四的一种所述的小单孢菌菌株制备的大环内脂类化合物，结构式如下
权利要求
1.一种小单孢菌菌株，其特征在于所述菌株为小单孢菌菌株FIM07-0019 (Mciromonospora sp. FM07-0019)，于 2012 年 8 月 23 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6474。
2.一种如权利要求I所述的小单孢菌菌株的分离方法，其特征在于包括以下步骤 步骤100 :将2克采集于智利南部43° 32' 0' S，72° 52' 0' W，水深20米的海底海泥用无菌陈海水稀释成KT1和10_2倍； 步骤200 :分别取原液及稀释过的样品悬液0. ImL涂布于燕麦琼脂培养基进行菌种分离，并于30°C下培养2周，得到小单孢菌菌株FM07-0019。
3.如权利要求2所述的小单孢菌菌株的分离方法，其特征在于所述燕麦琼脂培养基组分为燕麦粉2%、琼脂2%、重铬酸钾50mg/L、微量元素溶液0. lml/100ml，其余成分为水，且所述水包括质量比为I : I的蒸馏水和海水；所述微量元素溶液包括如下组分FeSO4 7H20 0. lg, MnCl2 4H20 0. lg, ZnSO4 7H20 0. lg，蒸馏水 1000ml。
4.一种利用权利要求I所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)制备小单孢菌菌株FM07-0019发酵液将一钼环小单孢菌菌株FM07-0019的燕麦琼脂斜面培养物接入种子培养基，于温度35°C，转速220rpm/min下培养48h ;然后按10%的移种量转入发酵培养基，并于温度28°C，转速220rpm/min下振荡培养96 120h ； (2)提取将(I)中获得的小单孢菌菌株FM07-0019发酵液于4500rpm离心15min以获得上清液和菌丝体；所述菌丝体用2倍于菌丝体体积的甲醇浸泡，经减压浓缩后再用水稀释；将稀释液与上清液合并后一起流经大孔吸附树脂Hp-20，再用甲醇洗出并浓缩，最后浓缩物用等体积的乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得浸膏状提取物； (3)分离将(2)中获得的提取物采用正相硅胶柱层析，用体积比100 0,98 2，95 5，90 10，80 20,70 30,50 50，0 100的氯仿-甲醇溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，并收集Rf值为0.6的馏份；再经S印hadex LH-20凝胶柱层析，用体积比I : I的甲醇_氯仿洗脱，薄层层析检测，并收集Rf值为0. 6的馏份；再经C18反相柱层析，以甲醇-水梯度洗脱，流速为lml/min，且所述甲醇-水梯度为甲醇含量在30min内从0到100%;薄层层析检测，并收集Rf值为0. 6的馏份；再将馏份经制备型高压液相色谱进行分离，以60%乙腈溶液洗脱，流速为I. 5ml/min，得到大环内脂类化合物。
5.如权利要求4所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，其特征在于所述薄层层析的展层剂为体积比9I氯仿-甲醇溶剂。
6.如权利要求4所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，其特征在于所述种子培养基的组分为可溶性淀粉1.5%，葡萄糖0. 5 %，蛋白胨0. 5 %，酵母粉0. 5 %，MgSO4 7H20 0. 05%, NaCl 0. 05%, (NH4)2SO4O. 05%, K2HPO4 0. 05%, CaCO3 0. 1%，蒸馏水配制，pH为7. 5 ;且所述种子培养基中各组分的百分数均为质量分数。
7.如权利要求4所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，其特征在于所述发酵培养基的组分为可溶性淀粉4 %，葡萄糖0. 5 %，蛋白胨0. 5 %，花生饼粉2. 0 %，MgSO4 7H20 0. 05%, K2HPO4 0. 05%, CaCO3 0. 1%，蒸馏水配制，pH 为 7. 5，且所述发酵培养基中各组分的百分数均为质量分数。
8.一种利用权利要求I所述的小单孢菌菌株制备的大环内脂类化合物，其特征在于结构式如下
全文摘要
本发明提供了一种小单孢菌菌株、制备方法及其应用，本发明从海洋沉积物中分离并筛选到一株抗肿瘤活性很好的放线菌，该放线菌为小单孢菌菌株FIM07-0019(Mciromonospora sp.FIM07-0019)，并利用该小单孢菌菌株FIM07-0019制备出发酵液，再将所述发酵液经提取、正相硅胶柱层析、C18反相柱层析等处理，提取分离得到对肿瘤细胞具有细胞毒活性的大环内酯类化合物，该大环内酯类化合物为研究开发新的抗肿瘤药物提供了天然药物化学研究基础和先导化合物，对开发利用中国的海洋药物资源具有重要价值。
文档编号C12N1/20GK102965300SQ20121034785
公开日2013年3月13日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者彭飞, 连云阳, 王传喜, 谢阳, 林如, 江宏磊, 江红 申请人:福建省微生物研究所