检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的引物对及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，涉及一种检测植物乳杆菌的引物对及方法，具体地说 是一种检测LactobacillusparacaseiN1115菌株的引物对及方法。
【背景技术】
[0002] LactobacillusparacaseiN1115 (CGMCC4691)是具有优良益生特性的乳杆 菌。该菌株在消化系统中具有优异的耐受胃酸、胆盐和牛磺胆酸钠水解的能力，其具有 乳杆菌共同的特性，即为革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性、硝酸盐还原试验阴性、不液 化明胶、无运动性、能在PH4. 5的BLB液体培养基中生长发育。只有在对Lactobacillus paracaseiN1115 (CGMCC4691)进行准确定量的基础上，才能够更有针对性地深入了解适 宜LactobacillusparacaseiN1115 (CGMCC4691)体内定植的条件，从而更进一步地开发 出具有相对更为优良的LactobacillusparacaseiN1115 (CGMCC4691)体内定植率的产 品，更好地发挥LactobacillusparacaseiN1115 (CGMCC4691)的作用。
[0003] 由于同种益生菌不同菌株之间的相似性超过了 99%，常用的分子生物学手段很难 从菌株水平对益生菌进行区分，因此，需要根据不同益生菌之间的遗传结构和特点，找出不 同菌株的专有特征，并从菌株水平对该菌株进行分子标记，寻找特异性的检测方法显得尤 为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题，是提供一种检测LactobacillusparacaseiN1115菌 株的引物对，该引物对中，一条引物的序列如SEQIDNO. 2所示，另一条引物的序列如SEQ IDN0. 2所示，该引物检测的特异性良好、灵敏度高； 本发明还提供了利用前述引物对检测LactobacillusparacaseiN1115菌株的方法， 包括DNA提取、PCR扩增及电泳检测分析，该方法能够快速检测出菌株的数量，检测特异性 高，能够区分LactobacillusparacaseiN1115 (CGMCC4691)菌和同源性较高的其他菌 株。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是： 一种检测LactobacillusparacaseiNl115菌株的引物对，该引物对中，一条引物的序 列如SEQIDN0. 2所示，另一条引物的序列如SEQIDN0. 2所示。
[0006] 本发明还提供了一种检测LactobacillusparacaseiN1115菌株的方法，它按照 如下的步骤顺序进行： 1) 提取待测样品菌株DNA，得A; 2) 以A为模板，以前述的引物对进行PCR反应，得B; 3) 将B进行电泳检测，具有前述的引物扩增片段的样品中存在Lactobacillus paracaseiN1115 菌株。
[0007] 作为本发明的一种限定，所述的PCR扩增体系包括2XPCRMix10yL，40mmol/L 上游引物和下游引物各1 yL，40 ng/yL的DNA模板1yL。
[0008] 作为本发明的另一种限定，步骤2)所述的PCR反应程序为95°C变性5min;95°C变 性lmin，65°C退火 45s，72°C延伸 30s，循环 30 次；72°C延伸 5min，4°C保存。
[0009] 由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于： 本发明提供的检测Lactobacillus paracasei Nil 15菌株的引物对，该引物对中，一条 引物的序列如SEQIDN0. 2所示，另一条引物的序列如SEQIDN0. 2所示，该引物检测的特 异性良好、灵敏度尚； 本发明还提供了检测该菌株的方法，能够快速检测出菌株的数量，检测特异性高，能够 区分Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)菌株和同源性较高的其他菌株。
[0010]本发明适用于对Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)菌株进行检测， 进一步地对食品或者乳制品中Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)菌株进行 检测计数。
【附图说明】
[0011]图1为Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)菌株特异性引物和扩增 的目的基因信息图； 图2为LactobacillusparacaseiN1115 (CGMCC4691)菌株的特异性扩增条带图；其 中：Lanel为D2000Marker，Lane2为PCR产物，Lane3为具有目的片段的质粒DNA扩增产 物，作为阳性对照，Lane4为无菌水扩增产物，作为阴性对照； 图 3 为Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)的Q-PCR扩增标准曲线图； 图4为引物筛选试验中利用不同的引物对菌株的DNA扩增条带图（其中：M为D2000Marker，Lanel为副干酷乳杆菌N1115，Lane2为干酷乳杆菌CICC6117，Lane3为植物 乳杆菌JMCC0108, Lane4为鼠李糖乳杆菌JMCC1001); 图5引物筛选试验中利用本发明提供的引物对菌株的DNA扩增条带图（其中：M为D2000Marker，Lanel为副干酷乳杆菌N1115，Lane2为干酷乳杆菌CICC6117，Lane3为：植 物乳杆菌JMCC0108,Lane4为鼠李糖乳杆菌JMCC1001); 图6为不同退火温度下LactobacillusparacaseiN1115 (CGMCC4691)菌株的特异 性扩增条带图（其中：M为D2000Marker，Lanel为65°C退火样品，Lane2为68°C退火样品， Lane3为58°C退火样品，Lane4为55°C退火样品）。
【具体实施方式】
[0012] 本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。
[0013] 下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0014] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业渠道得到。
[0015]实施例 1 一种检测Lactobacillus paracasei Nil15菌株的方法 本实施例提供了一种检测Lactobacillus paracasei N1115菌株的方法，待测样品以 发酵乳制品为例，检测方法按照如下的步骤顺序进行： 1)样品中宏基因组DNA的提取： 采用液氮冻融-CTAB法提取样品中宏基因组DNA; ① 取1.Og样品洗涤处理，将洗脱的菌体置于1. 5mL离心管中，并立即将该离心管置于 液氮中完全冻结，取出后放入65°C水浴中融化(约5min)，反复冻融3次，得a; ② 向a加0.lmL10%SDS和10. 0μL10mg/mL蛋白酶K，于37°C恒温摇床中200r/min 摇动2h，室温下12000rpm心lOmin，收集上清液转移至另一离心管中，得b; ③ 向上清液b中加入等体积的氯仿，于12000rpm离心lOmin，得c; ④ 为了使沉淀、水相和有机相分层，吸取c中上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿 抽提2次(苯酚与氯仿的体积比为25 :24)，得上清液d; ⑤ 向d加入0. 1倍体积的醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇，沉淀总DNA，然后用70%乙醇 洗涤沉淀2次，回溶即得A，备用； 2)Q-PCR检测 ① 检测Lactobacillus paracaseiN1115 (CGMCC4691)的特异性引物序列如下： SEQIDNo. 2:5r -ttcaccagatggaaggactc-3' SEQIDNo. 3:5r -tcaatgttcgctgcctgt-3r ； ②Q-PCR扩增、检测 应用已知数量的Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)通过Q-PCR扩增制 作标准曲线，如图3所不；由图3可见，Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)标 准品的Ct值和拷贝数呈较好的线性关系，以模板初始拷贝数的对数为横坐标、Ct值为纵 坐标绘制出的荧光定量PCR标准曲线方程为：Υ=_3. 45X+38. 383(其中Y代表Ct值，X代 表模板初始拷贝数的对数)，模板初始拷贝数与Ct值之间的线性相关系数为0. 9999,斜率 为-3. 45,所建立的标准曲线符合荧光定量PCR的要求； 以A为模板，用上述特异性引物通过Q-PCR扩增样品的基因组DNA，测定待测样品的Ct值。然后以标准曲线为依据，将所获得的待测样品的Ct值代入标准曲线方程，可以确定待 测样品中LactobacillusparacaseiN1115 (CGMCC4691)菌株的量。结果与分析误差结果 显示在下表1中； Q-PCR反应体系：10mmol/L的上游引物，10mmol/L的下游引物，40ng/yL的DNA模 板； Q-PCR反应参数：95°C变性15min; 95°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸lmin，循环 40次。
[0016]表1样品内Lactobacillus paracasei N1115 (CGMCC4691)的数量
本实施例中所提供的特异性引物特异性良好、灵敏度高；检测该菌株的方法，能够快速 检测出菌株的数量，检测特异性高。
[0017]实施例 2 -种检测Lactobacillus paracaseiNil15菌株的方法 待测样品以发酵乳制品为例，检测方法按照如下的步骤顺序进行。
[0018] 1)样品中宏基因组DNA的提取： 采用液氮冻融-CTAB法提取样品中宏基因组DNA。
[0019] ①取1. 0g样品洗涤处理，将洗脱的菌体置于1. 5mL离心管中，并立即将该离心管 置于液氮中完全冻结，取出后放入65°C水浴中融化(约5min