一种bcr-abl融合基因t315i突变荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，更为具体地说，涉及一种BCR-ABL融合基因T315I 突变荧光PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] CML(chronicmyelogenousleukemia，即慢性粒细胞白血病）占所有白血病的15~ 20%，是人类发现的第一个与基因异常相关的血液系统恶性肿瘤，90%以上患者可检测到 特征性的Ph染色体及其分子标志BCR-ABL融合基因。目前，针对CML的抗肿瘤药物主要为 酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosinekinaseinhibitor，TKI)。BCR-ABL融合基因的突变会导致肿 瘤细胞耐药性的产生，点突变能够引起ABL激酶区的氨基酸发生改变，阻断TKI与ABL激 酶的结合或者妨碍ABL激酶失活构象的形成，从而干扰药物与靶位点的结合，最终导致耐 药的发生。ABL激酶区基因点突变的检出率在耐药患者中约为30~90%，几乎所有的CML 急变期和15~20%的CML经过頂治疗后复发的患者均会对頂产生耐药性。当TKI的剂 量增加或者更换第二代信号转导抑制剂时，临床上大多数的突变型CML对上述改变有效， 但具有BCR/ABLT315I突变的CML对上述药物均无效，而且患者病情因此迅速恶化，最终死 亡。
[0003] 在TKI耐药或复发的CML患者中发现100多种BCR-ABL基因的突变，不同基因位点 的突变所导致的耐药程度不同。位于酪氨酸激酶（ABL)ATP结合区域的ABL基因第6外显子 的T315I突变耐药性最为明显。T315I突变在BCR-ABL融合基因中的突变频率约为30%， 远远高于其它突变形式的突变频率。T315I突变所致的耐药最难克服，为高度耐药。T315I 突变是发生在药物与ABL激酶区接触点的突变，由位于ABL基因第6号外显子的第315位苏 氨酸（Thr)被异亮氨酸（lie)所替代，碱基由ACT变为ATT。突变发生后Ile315不能与TKI 形成氢键，且替代后的lie侧链上的额外碳氢键会产生空间上的干扰，不利于lie与TKI的 结合，由此便会产生耐药性。BCR-ABL融合基因的ABLT315I突变在临床上被用作CML药物 治疗指导的主要指针，对CML耐药性的筛查及临床科学用药具有重要的指导意义。
[0004] 研究表明，由于患者基因背景的不同，药物在体内的代谢、药物治疗的有效性以及 副反应、甚至患者的预后都存在个体差异。因此，对药物作用相关基因的检测，可指导医生 对患者准确施药，规避药物副作用，同时提高病人乃至社会的医疗费用效率。
[0005] 目前，用于检测人BCR-ABL融合基因T315I突变的方法主要包括直接测序法、高效 液相色谱法及FQ-PCR(fluorescencequantitative-PolymeraseChainReaction，即焚光 定量聚合酶链式反应）等。而随着FQ-PCR技术的发展，其在人BCR-ABL融合基因T315I突 变诊断领域的应用已越来越广泛，也越来越为人所重视，人BCR-ABL融合基因T315I突变的 实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越 性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒，以 提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的人BCR-ABL融合基因T315I突 变检测试剂盒。
[0007] 本发明提供如下技术方案：
[0008] -种BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括 T315I突变检测反应液，且所述T315I突变检测反应液包括10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷 三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针；所 述用于检测靶多核苷酸的探针的碱基对序列为：
[0009] 5 'FAM-TTCATGACCTACGGGAACCTCCTGGA-BHQ13 '。
[0010] 优选地，所述用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
[0011] 上游引物：5' -GAGCCCCCGTTCTATATCATGAT-3' ；
[0012] 下游引物：5 ' -AGCACCACGGCGTTCACC-3 '。
[0013] 优选地，所述检测试剂盒还包括内标，所述内标为BCR-ABL融合基因中ABL基因4 号外显子，且所述内标的序列为：
[0014] 5 '-GCCGAGTTGGTTCATCATCATTCAACGGTGGCCGACGGGCTCATCACCACGCTCCATTATCCAGCC CCAAAGCGCAACAAGCCCACTGTCTATGGTGTGTCCCCCAACTACGACAAGTGG-3 '。
[0015] 优选地，所述T315I突变检测反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标 的探针的碱基对序列为：5'HEX-CACGCTCCATTATCCAGCCCCAAA-BHQ13'。
[0016] 优选地，所述T315I突变检测反应液还包括用于扩增内标的上游引物以及下游引 物；所述上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
[0017] 上游引物：5' -GCCGAGTTGGTTCATCATCATT-3' ；
[0018] 下游引物：5 ' -ATAGACAGTGGGCTTGTTGCG-3 '。
[0019] 优选地，所述10XPCR缓冲液包括pH值为7. 5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐溶液、浓度为30mmol/L的氯化镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为 0. 2%的曲拉通溶液和体积比为10%的甲酰胺溶液。
[0020] 优选地，所述脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dGTP、dUTP或dTTP。
[0021 ] 优选地，所述检测试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液包括1U/μ1~5U/μ1的 耐热DNA聚合酶和0. 05U/μ1~0. 2U/μ1尿嘧啶DNA糖基化酶。
[0022] 优选地，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为包含内标目的序列片 段的质粒和BCR-ABL融合基因T315I突变位点所在区域片段质粒的混合物。
[0023] 优选地，所述检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为灭菌水稀释的内标目 的序列片段的质粒。
[0024] 本发明所提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒包括T315I突 变检测反应液，且所述T315I突变检测反应液包括10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、 用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。本发明所提 供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒是基于实时荧光定量PCR技术和 ARMS-PCR技术的检测试剂盒，该检测试剂盒具有很好的特异性，且操作快速、方法简便、检 测精度高。
【附图说明】
[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动 的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0026] 图1是本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒对 弱阳性精密度参考品测试的扩增曲线图；
[0027] 图2是本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒对 强阳性精密度参考品测试的扩增曲线图；
[0028] 图3是本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒对 野生型人DNA测试的扩增曲线图；
[0029] 图4是本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒对 含1%T315I基因突变的人DNA测试的扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0030] 本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒，以提供 一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的BCR-ABL基因突变检测试剂盒。
[0031] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明实 施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明实施例中的技术 方案作进一步详细的说明。
[0032] 本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒包 括T315I突变检测反应液，且所述T315I突变检测反应液包括5yL的10XPCR缓冲液、 0· 2mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、0· 2μ mol/L~0· 4μ mol/L的用于扩增祀多核苷酸的上 游引物以及下游引物和〇· 2ymol/L~0· 4ymol/L的用于检测靶多核苷酸的探针。
[0033] 本发明通过应用DNAStar软件包中的SeqMan和MegAlign软件对Genbank中检索 到的ABL基因序列，在BCR-ABL融合基因T315I位置进行同源性比较，并针对该突变位置设 计了 2套各包含有一条特异性引物ARMS引物、一条下游引物和一条探针的引物探针组合， 经优化，筛选出了扩增效果相对较好的一对用于扩增靶多核苷酸的探针和上下游引物，该 探针和引物源于人BCR-ABL融合基因T315I突变所在外显子区域。
[0034] 其中，该探针的碱基对序列为：5'FAM-TTCATGACCTACGGGAACCTCCTGGA-BHQ13'；
[0035] 用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
[0036] 上游引物：5 ' -GAGCCCCCGTTCTATATCATGAT-3 '；
[0037] 下游引物：5 ' -AGCACCACGGCGTTCACC-3 '。
[0038] 本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒检测的突 变位点在检测基因的具体位置为密码子315处，且碱基的变化为ACT>ATT。由于采用了 上述探针和上下游引物，能够在50ng/反应的野生型DNA背景下实现1 %突变型人BCR-ABL 融合基因100%检出且野生型人BCR-ABL融合基因零检出，说明本发明试剂盒具有很好的 特异性以及极强的抗干扰能力，大大降低了假阳性率。
[0039] 本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒进一步包 括内标，即包括阳性内对照，该内标为BCR-ABL融合基因中ABL基因4号外显子。在本检测 试剂盒中，该内标可以监控DNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，进而防止样 本中可能存在的抑制物干扰检测，并使检测结果呈假阴性。其中，该内标的碱基对序列为：
[0040] 5 '-GCCGAGTTGGTTCATCATCATTCAACGGTGGCCGACGGGCTCATCACCACGCTCCATTATCCAGCC CCAAAGCGCAACAAGCCCACTGTCTATGGTGTGTCCCCCAACTACGACAAGTGG-3 '。
[0041] 本发明实施例提供的T315I突变检测反应液还包括用于检测内标的探针，该探针 的碱基对序列为：5'HEX-CACGCTCCATTATCCAGCCCCAAA-BHQ13'。
[0042] 同时，本发明实施例还提供了用于扩增内标的上下游引物，该上下游引物的碱基 对序列为：
[0043]上游引物：5 '-GCCGAGTTGGTTCATCATCATT-3'；
[0044] 下游引物：5 ' -ATAGACAGTGGGCTTGTTGCG-3 '。
[0045] 进一步，本发明实施例提供的检测试剂盒中的10XPCR缓冲液包括pH值为7.5的 20