一种葡萄糖基转移酶基因及其制备方法和重组工程菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶的基因工程和酶的生化工程领域，涉及一种野油菜黄单胞菌野油菜 致病变种dMiAomwas )的葡萄糖基转移酶的序列，涉及含 有该酶基因的制备方法、重组工程菌和应用。
【背景技术】
[0002] 熊果苷（Arbutin)化学名称为对-羟基苯-D-吡喃葡萄糖苷，最早发现于熊果叶 中，其有两种差向异构体，即α和β型熊果苷。熊果苷最初应用于药物中，有抗菌、消炎、 利尿、镇咳的作用。自上世纪80年代，研究发现熊果苷作为酪氨酸酶的竞争抑制剂，能抑制 黑素形成过程中关键酶酪氨酸酶的活性，因此有美白的效果。日本资生堂公司首先将熊果 苷应用于美白化妆品中，目前国内外也有多家厂商将熊果苷添加美白类化妆品中。故熊果 苷有很大的市场应用前景。
[0003] 通过相关研究发现，β -熊果苷在β -葡萄糖苷酶的作用下可转化为氢醌，而氢醌 因具有潜在的致敏性和致癌性，除美甲和染发类化妆品外，在其他化妆品中为禁用物质。相 对于β -熊果苷，α -熊果苷具有更好的生物稳定性和美白活性，由于其抑制酪氨酸酶的原 理的差异，导致α-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的15倍。按照目前的技术，β-熊果 苷几乎都是由化学法合成，而α-熊果苷仅限于通过生物转化法合成。
[0004] 随着基因工程技术的发展，通过克隆葡萄糖基转移酶基因实现其在大肠杆菌中的 过量表达，这样可以降低生产周期，提高生产效率，更加有利于工业化生产。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种葡萄糖基转移酶基因及其制备方法，本发明的第 二个目的是提供所述基因的重组工程菌和其应用。本发明运用基因工程技术，将野油菜黄 单胞菌野油菜致病变种中的葡萄糖基转移酶基因进行克隆，并导入大肠杆菌中进行重组表 达，从而提供一种高效、绿色、安全、低成本的一步法催化对苯二酚生产α -熊果苷的方法。
[0006] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案： 本发明提供了一种葡萄糖基转移酶基因，所述的葡萄糖基转移酶基因是从野油菜黄单 胞菌野油菜致病变种（XafliAomwa1S )中克隆而来，所述的葡 萄糖基转移酶核苷酸序列为SEQ ID No. 1。
[0007] 本发明提供了一种葡萄糖基转移酶基因，所述的葡萄糖基转移酶核苷酸序列为 SEQ ID No. 1，其命名为agl，全长为1617bp，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No. 2,蛋白质的氨基酸数为538个氨基酸。
[0008] 本发明还涉及从NCBI数据库上获得葡萄糖基转移酶基因的序列，并设计引物。由 于实验采用一步法克隆试剂盒（One Step Cloning Kit)进行克隆，可将插入片段PCR产物 定向克隆至任意载体的任意位点。其引物设计总的原则是：通过在引物5'端引入线性化克 隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5'和3'最末端分别带有和线性化克隆载体 两末端对应的完全一致的序列（15-20bp)。
[0009] 作为优选，按如上方法设计引物为：agl-one-step-F :5' -GAAGGAGATATACCATGTCG CAGACACCATG-3' ；agl-〇ne-step-R:5' -AGTGCGGCCGCAAGCTTCAGCCACGACCGAC-3' 〇
[0010] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案： 上述的葡萄糖基转移酶基因的重组工程菌。
[0011] 本发明以Xcc基因组DNA为模板，通过引物退货温度优化获得一个最佳的退火温 度，PCR获得葡萄糖基转移酶基因。同时本发明要对载体进行线性化处理，按照操作说明，采 用双酶切线性化，因为该法线性化完全，转化背景低。上述的重组工程菌的构建方法，该重 组工程菌的载体用Nde I和Hind III双酶切线性化后，将两端带有载体末端序列的PCR产 物和线性化载体按一定比例混合后，在重组酶Exnase的催化下，在37°C下反应30min重组 完全，完成定向克隆。
[0012] 所述葡萄糖基转移酶基因重组工程菌的构建，本发明所述的重组表达载体通过本 领域一种最新技术将本发明的葡萄糖基转移酶基因连接于各种表达载体上构建而成。实验 室常用的载体有pMD 19-T、pUCM-T、pET20b、pET22b、pET28a、pET32a等。本发明考虑到目 的基因的表达严谨性，选择pET28a作为重组载体。
[0013] 本发明涉及一种由上述重组表达载体转化得到的重组基因工程菌。发明通过将 上述重组表达载体转化到大肠杆菌表达宿主中，由于大肠杆菌表达外源基因具有明显的优 势，例如对其进行全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架，代谢途径清晰；基因克隆 表达系统成熟完善；繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；被美国FDA批准为安全的 基因工程受体生物。本发明优选大肠杆菌Rosetta TM(DE3)[F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm (DE3) pRARE2 (CamR)]，该感受态细胞用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启 动子的表达载体(如PET系列）的基因。该菌株是携带氯霉素抗性质粒BL21的衍生菌，补 充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)对应的tRNA，提高 外源基因在原核系统中的表达水平。本法明将上述的重组载体pET28a-agl通过热机转化 法转化至Rosetta? (DE3)中，即可获得本发明优选重组基因工程菌，即Rosetta? (DE3)/ pET28a_agl。
[0014] 本发明还提供了所述的重组工程菌诱导剂葡萄糖基转移酶的方法，该方法包括以 下的步骤：重组工程菌接种至含有卡那霉素（50 μ g/mL)和氯霉素（35 μ g/mL)的LB培养基 中过夜培养l〇_12h，再以1~3%的接种量转接至同上的LB培养基中，当转接2-3h后，加入 终浓度为〇. l-l〇g/L的乳糖(优选lg/L)，放到20-30°C (优选28°C)的摇床上，诱导表达 8~15h，高效表达葡萄糖基转移酶。
[0015] 由于发明采用pET系列载体为表达载体，其上含有乳糖操纵子，考虑到诱导成本， 本发明采用乳糖作为诱导剂，对重组菌的蛋白表达进行优化。分别对乳糖的诱导时机，乳糖 的诱导浓度，重组工程菌的诱导温度等进行优化，获得蛋白最大的表达量，高效表达葡萄糖 基转移酶。发明所述的乳糖诱导优化的培养基为细菌培养常用培养基Luria-Bertani培养 基，简称LB :配制每升培养基，在950 ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl l〇g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/LNa0H调pH至7. 0,用去离子水定容至1L。在15psi 高压下蒸汽灭菌20min。
[0016] 一种葡萄糖基转移酶催化对苯二酚生成α -熊果苷的方法，该方法包括以下的步 骤：将制备的携带有葡萄糖基转移酶的重组工程菌经培养离心获得的湿菌体，使其破碎离 心液作为催化剂，以1%_2%对苯二酚为底物，10%_40%麦芽糖为辅助底物(通过水解α -1， 4糖苷键使其产生两个葡萄糖，反应过程中水解产生葡萄糖并非处于游离状态，而是与酶 局限在很近的距离，彼此之间存在某种作用力互相牵制使其处于过渡状态，与对苯二酚的 酚羟基发生糖基化反应)，在pH 7. 0的IOOmM磷酸钠缓冲液中，在180rpm，30°C条件下反应 Mh0
[0017] 与现有的技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明克服了利用野油菜黄 单胞菌野生菌培养时，较难获得足够的催化剂用于 α -熊果苷的合成和较长的催化周期， 并且菌体培养液中存在黄原胶，对于后期产物分离纯化造成阻碍。而本发明利用重组大肠 杆菌催化合成Ct-熊果苷，可以在短时间内获得高密度的重组菌体用于催化合成α-熊果 苷，并且大大的缩短的催化周期，使其生产α -熊果苷的产量达21_30g/L，对苯二酚转化率 可达90%以上，且反应时间在2_4h之间，因此利用此大肠杆菌重组工程菌进行α -熊果苷 的生产具有良好的工业前景。
【附图说明】
[0018] 图1为野油菜黄单胞菌的基因组DNA电泳图，MjP M 2分别为1000 Obp Marker和 λ-Hind III digest Marker，1和2都为野油菜黄单胞菌的基因组DNA。
[0019] 图2为agl基因梯度PCR电泳图，M为2000bp Marker，l是以50°C为退火温度进行 PCR，2是以51. 6 °C为退火温度进行PCR，3是以54. 1°C为退火温度进行PCR，4是以57. 1°C为 退火温度进行PCR，5是以61. 2°C为退火温度进行PCR，6是以54. 5°C为退火温度进行PCR， 7是以66. 7°C为退火温度进行PCR，8是以68°C为退火温度进行PCR。
[0020] 图3线性化的载体和葡萄糖基转移酶基因的电泳图，MjP 别为1000 Obp Marker和2000bp Marker，1为线性化的载体，2为葡萄糖基转移酶基因。
[0021] 图