PLC检测其酶活 性。
[0044] 采用液相色谱检测的条件为：C1S柱色谱柱，250x4. 6 mm ;柱温：25°C ;流动相： CH3OH =H2O :C2HF302=90 :10 :0. 1 ;流速：0. 8mL · min S检测器：紫外检测器；检测波长： 287nm;进样量：10yL。
[0045] 结果显示，该工程菌的α -熊果苷的产量达21. 3g/L，对苯二酚转化率可达90%以 上，对苯二酚选择性也达90%以上。
[0046] 实施例6重组基因工程菌乳糖诱导pET载体表达重组蛋白 取-20°C保存的菌种100 μ L加入到装有50ml新鲜无菌的LB培养基中（50 μ g/ml的卡 那霉素、和35 μ g/ml的氯霉素)，37°C过夜培养10h。再以2%的接种量转接到装有50ml新鲜 无菌的LB培养基中（50 μ g/ml的卡那霉素、和35 μ g/ml的氯霉素)，在重组菌转接120min， 向摇瓶中加入250 μ L20%的乳糖溶液，至终浓度为0. 5g/L，然后28°C继续诱导10h，培养结 束后，于4°C、8000rpm离心10min收获菌体，接着菌体用50mM的pH 7. 2磷酸盐缓冲液洗 涤3次，将菌体放置在4°C冰箱保存。
[0047] 将获得的湿菌体进行超声破碎：以50mg/ml的菌体浓度悬浮于50mM磷酸盐平衡 缓冲液中（pH 7. 2, 20 g/L NaCl)，在冰水混合物中，以30%功率，工作2秒，间隔6秒，总时 长90min，中间跟换几次冰水混合物。待菌液澄清后，于4°C、15000rpm离心10min，取上清 于4°C保存，并跑蛋白电泳验证。
[0048] 实施例7重组基因工程菌酶学性质研究 1底物浓度对催化反应的影响 将携带有葡萄糖基转移酶的重组工程菌经培养离心获得的50mg/mL湿菌体，使其破 碎离心液作为催化剂，以0. 5%-5%对苯二酚为底物，40%麦芽糖为辅助底物，在pH 7. 0的 IOOmM磷酸钠缓冲液中，在180rpm，30°C条件下反应24h，用0. 01mol/L HCL稀释反应液10 倍，然后用HPLC检测其酶活性。结果如图8所示，最佳的底物浓度在1%-1. 5%之间，当底物 浓度大于1. 5%时，底物对于酶活具有明显的抑制。
[0049] 2温度对葡萄糖基转移酶酶活的影响 将携带有葡萄糖基转移酶的重组工程菌经培养离心获得的50mg/mL湿菌体，使其破碎 离心液作为催化剂，以1. 1%对苯二酚为底物，40%麦芽糖为辅助底物，在pH 7. 0的IOOmM磷 酸钠缓冲液中，分别在16、20、25、30、35、40、50°(：温度下反应1801^11，反应结束时用0.0说 盐酸溶液稀释10倍来终止反应，并用HPLC检测。结果如图9所示，在16-30°C，酶活缓慢 增加，在30-35Γ酶活达到最高，当温度大于40°C时酶活显著降低。说明该酶对高温比较敏 感，故选择催化温度是宁可温度第一点也不要选择高温。
[0050] 3 pH对葡萄糖基转移酶酶活 通过配置IOOmM的醋酸钠缓冲液（pH为4. 0、4. 5、5、5. 5)，IOOmM的磷酸钠缓冲液（pH为 6. 0、6. 5、7、7. 5、8. 0)。将携带有葡萄糖基转移酶的重组工程菌经培养离心获得的50mg/mL 湿菌体，使其破碎离心液作为催化剂，以1. 1%对苯二酚为底物，40%麦芽糖为辅助底物，在 不同缓冲体系中，于30°C下反应180min，反应结束时用0.0 lM盐酸溶液稀释10倍来终止反 应，并用HPLC检测。结果如图10所示，该酶在4. 0-5. 0之间酶活比较低，由于该酶的等电 点在4. 5附近，而如图10所示其最佳的反应pH在6. 5-7. 0之间，说明该酶比较适合在弱酸 和中性的缓冲体系下反应，并且该酶不耐酸碱，同时碱性环境下底物比较容易氧化，故应选 择一个弱酸和中性的缓冲体系用于催化反应。
[0051] 4金属离子对糖基转移酶酶活的影响 称取相应可溶性金属离子盐配制ImM Ba' Ca' Mg' Mn' Fe' Co' Zn' Fe' Ni' Cu' K+金属离子储液，将携带有葡萄糖基转移酶的重组工程菌经培养离心获得的50mg/mL 湿菌体，使其破碎离心液作为催化剂，以1. 1%对苯二酚为底物，40%麦芽糖为辅助底物，在 pH 7. 0的IOOmM磷酸钠缓冲液中，使其在30°C反应180min，反应结束时用0.0 lM盐酸溶液 稀释10倍来终止反应，并用HPLC检测。结果如图11所示，其中Mn2+可使酶活损失10%左 右，而Cu 2+可使酶活损失几乎100%，而K +可使酶活增加20%左右，故可以使用K +缩短反应 时间，用Cu2+来终止反应。
[0052] 5糖基转移酶酶活的反应进程 在最佳条件下，并提高K+终浓度到IOOMm,在0min、30min、60min、90min、120min、 150min、180min、210min、240min、270min时取样，并用HPLC检测。如图12所述，反应在进行 到180-210min时基本已经达到最大，而且根据反应的性质，该反应是可逆反应，反应时间 久了，很可能反应会朝着逆反应方向进行，故生产中我们应及时终止反应。
【主权项】
1. 一种来源于野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xai?iAomwascanoesiris j〇K.ca^oe^iris)的一种葡萄糖基转移酶基因，所述的葡萄糖基转移酶基因的核苷酸序列为 SEQIDNo. 1。2. 权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于该蛋白质的的氨基酸序列为SEQID No. 2 〇3. 权利要求1所述基因的制备方法，其特征在于该方法采用一步法克隆试剂盒（One StepCloningKit)进行克隆，将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点；其引 物设计总的原则是：通过在引物5'端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩 增产物5'和3'最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的引物为： agl-one-step-F:5'-GAAGGAGATATACCATGTCGCAGACACCATG-3' ；agl-〇ne-step-R:5'-A GTGCGGCCGCAAGCTTCAGCCACGACCGAC-3 ' 〇5. 权利要求1所述基因的重组工程菌。6. 根据权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于重组载体为pET28a。7. 根据权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于工程菌宿主选用大肠杆菌 Rosetta? (DE3)[F-ompThsdSB(rB-mB- )galdcm(DE3)pRARE2 (CamR) ] 〇8. 权利要求5所述的重组工程菌的构建方法，其特征在于该重组工程菌的载体用Nde I和HindIII双酶切线性化后，将两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化载体按一定 比例混合后，在重组酶Exnase的催化下，在37°C下反应30min重组完全，完成定向克隆。9. 权利要求5所述的重组工程菌诱导剂葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于该方法包 括以下的步骤：重组工程菌接种至含有卡那霉素和氯霉素的LB培养基中过夜培养10-12h， 再以1~3%的接种量转接至同上的LB培养基中，当转接2-3h后，加入终浓度为0.l-10g/L 的乳糖，放到20-30°C的摇床上，诱导表达8~15h，高效表达葡萄糖基转移酶。10. -种葡萄糖基转移酶催化对苯二酸生成α-熊果苷的方法，其特征在于该方法包 括以下的步骤：将权利要求5所述的重组工程菌经培养离心获得的湿菌体，使其破碎离心 液作为催化剂，以1%_2%对苯二酚为底物，10%_40%麦芽糖为辅助底物，在pH7. 0的100mM 磷酸钠缓冲液中，在180rpm，30°C条件下反应24h。
【专利摘要】本发明公开了一种葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建、表达和应用，所述的葡萄糖基转移酶基因的核苷酸序列为SEQ？ID？No.1，其基因来源于<i>Xanthomonas？campestris？pv.campestris</i>。本发明利用一步法克隆试剂盒用于基因的克隆，并将目的基因连接到pET系列载体中，并导入大肠杆菌Rosetta?(DE3)？[F?？ompT？hsdSB(rB?？mB?？)？gal？dcm？(DE3)？pRARE2？(CamR)]中。对重组大肠杆菌利用乳糖作为诱导剂进行蛋白表达优化，并对葡萄糖基转移酶催化合成α-熊果苷的酶学性质进行研究。采用本发明优化后生产α-熊果苷的产量达21-30g/L，对苯二酚转化率可达90%以上，且反应时间在2-4h之间，利用此大肠杆菌重组工程菌进行α-熊果苷的生产具有良好的工业前景。
【IPC分类】C12N9/10, C12N15/70, C12N15/54, C12N15/10, C12N1/21
【公开号】CN105385700
【申请号】CN201510680846
【发明人】陈小龙, 王益栋, 范永仙, 陆跃乐
【申请人】德清爵胜生物科技有限公司
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年10月20日