专利名称：一种具有溶栓活性的沙蚕激酶的编码基因序列及其氨基酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有溶栓活性的沙蚕激酶的编码基因序列及其氨基酸序列，属于医药生物工程领域。
背景技术：
溶栓激酶是具有溶栓活性的一类酶的总称，其中临床上已正式批准使用的溶栓激酶有链激酶，尿激酶，重组组织血纤维蛋白溶酶原激活剂，对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活合剂复合物等。近年来一种来源于蚯蚓体内的天然溶栓药物蚓激酶引起了科学界的广泛关注并已应用于临床。
沙蚕激酶是来自于海洋生物双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis Grube)体内的一种具有溶栓活性的丝氨酸蛋白酶。双齿围沙蚕与蚯蚓同属于环节动物门，国内外有关沙蚕的研究报道不多，仅有少数文献报道从双齿围沙蚕体内提取一种能降解纤维蛋白的纤溶酶，而对其氨基酸序列和编码基因并没有任何报道。
由于沙蚕激酶具有降解纤维蛋白的活性，其极有可能成为继蚓激酶之后又一具有较好开发前景的新型溶栓激酶药物。为了在保护沙蚕资源的同时提供足够用于医疗的沙蚕激酶，人们必然会选择通过医药生物工程技术来实现沙蚕激酶的大规模工业化生产。为此，人们首先必须获得确切的沙蚕激酶的氨基酸序列及其编码基因，才能够进行基因工程操作，构建表达沙蚕激酶的表达载体并在原核和真核表达系统表达该蛋白。
然而遗憾的是，到目前为止，国内外尚无从沙蚕基因组cDNA文库中分离、克隆编码沙蚕激酶的编码基因、并在体外经基因重组技术进行表达、从而获得编码沙蚕激酶的基因序列的报道，也因此无法得到沙蚕激酶的确切的氨基酸序列。这种现状极大地阻碍了人们将沙蚕激酶开发成药物的研究进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有溶栓活性的沙蚕激酶的编码基因序列。
本发明的另一个目的是提供这种具有溶栓活性的沙蚕激酶的氨基酸序列。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案采用DNA操作技术，以来自沙蚕消化道上皮细胞的cDNA文库为模板，利用RACE(cDNA末端快速扩增)技术，经聚合酶链式反应扩增沙蚕激酶编码基因。将扩增的DNA条带经DNA克隆重组技术导入TA-载体中，将重组的TA-载体导入大肠杆菌E.coli，通过β-半乳糖苷酶插入失活及限制性内切酶酶切反应鉴定阳性重组克隆，将阳性重组克隆经TA-载体克隆位点上游的通用引物进行DNA序列测定(使用ABIDNA自动序列测定仪)，得到本发明的沙蚕激酶编码基因的DNA(mRNA)序列。使用DNASATR软件，根据这个沙蚕激酶编码基因的DNA(mRNA)序列，得出沙蚕激酶的蛋白质的化学一级结构(氨基酸序列)。
一种具有溶栓活性的沙蚕激酶的编码基因序列，该序列如下atggaggtaactgtgttctctcgctctgaatgtgaaactttttggggcagttccatcaatgatggccatgtctgtgtcggtgtcattggctctgctggtgcctgtaacggagactccggtggccctctggcagcatctgaaaaactggttggcgtgacatcatttggactcagtggatgcttcaccagtcgcccatccgtgtacagcagcattgagaacttcagggagttcatcgacagtgtcatgcaa。
以上序列为沙蚕激酶的原始编码序列，运用基因工程的方法可对其结构进行改造，得到沙蚕激酶的编码基因序列的衍生序列，该衍生序列包括新分离的具有与以上所述结构同样基本结构的基因序列及使用体外DNA操作技术通过碱基的置换、插入、缺失获得的该基因序列的各种变构体。
根据沙蚕激酶的原始编码序列，得到一种具有溶栓活性的沙蚕激酶的氨基酸序列，该序列如下MEVTVFSRSECETFWGSSINDGHVCVGVIGSAGACNGDSGGPLAASEKLVGVTSFGLSGCFTSRPSVYSSIENFREFIDSVMQ。
该序列为沙蚕激酶的原始氨基酸序列，通过改构可以得到一种具有溶栓活性的沙蚕激酶的氨基酸序列的衍生序列，该衍生序列与上述具有溶栓活性的沙蚕激酶的编码基因序列的衍生序列相对应，包括在相应蛋白质的氨基酸序列基础上经过单个或多个氨基酸的置换、插入、缺失等形成的各种变构体。
本发明的有益效果是根据本发明的沙蚕cDNA文库沙蚕激酶编码基因的DNA(mRNA)序列，可以从多种沙蚕的cDNA文库中克隆沙蚕激酶编码基因，该编码基因通过基因重组技术，可以在真核表达系统(如酵母细胞或动物细胞)或原核表达系统(如大肠杆菌)中获得重组表达，重组沙蚕激酶具有溶栓生物学活性，是新的基因工程药物。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为诱导后菌体蛋白SDS-PAGE电泳鉴定图谱，左侧为菌体蛋白，中间为蛋白Marker，右侧为纯化后融合蛋白。
图2为沙蚕激酶生物活性测定图。
具体实施例方式
实施例1、沙蚕激酶编码基因的分离、克隆及序列测定一、材料1、活双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis Grube)，属于环节动物门(Annelida)、多毛纲(Polychaeta)、游走目(Errantia)、沙蚕科(Nereidiae)、围沙蚕属(Perinereis)，采自青岛市近海；2、Trizol试剂、5’RACE试剂盒(Invitrogen公司)，反转录试剂盒、T-A Easy试剂盒、Wizard DNA纯化试剂盒、DNase、RNase H(Promega公司)，Taq酶(上海生工)。
二、方法1、从沙蚕的消化道上皮细胞中构建丝氨酸蛋白酶家族cDNA文库RNA提取取沙蚕消化道组织约20g，Hanks液洗净，研细并做细胞记数。Trizol一步法获得其消化道上皮细胞总RNA，DNase处理后备用。
反转录以(dT)21为引物，以DNase处理后的RNA为模板，加入禽反转录酶(AMV)，42℃水浴50min，95℃3min灭活反转录酶，获得总cDNA。
PCR扩增以丝氨酸蛋白酶家族的保守氨基酸序列GDSGGP设计引物5’-GGTGACTCYGGYGGCCCT-3’(P1)。取上述cDNA模板2ul，以P1和(dT)21为引物在25ul反应体系中扩增，同时设阴性水对照。
CDNA文库的构建将扩增得到的所有片段连接到T-A Easy Vector上，并转化JM109，进行序列测定(上海生工)。测定10个克隆，测序结果表明该10个克隆中含有两种DNA片段。
2、利用5’-RACE的方法获得沙蚕激酶的cDNA克隆以上述两个不同的DNA片段分别设计不同的引物。利用Invitrogen公司5’RACE试剂盒扩增这两个片段的5’端，将扩增获得的产物连接到T-A Easy Vector上，并转化JM109，进行序列测定(上海生工)。获得两个具有完整读码框架的的克隆，其中一个为编码沙蚕激酶的cDNA克隆。
3、序列所编码氨基酸性质的分析将上述两个完整序列所编码的氨基酸使用瑞士生物信息院提供的蛋白质在线分析工具PROPSEARCH、SAPS、NNPREDICT和SWISS-MODEL对蛋白质的物理性质、二级结构、三级结构进行分析和模拟，并在SWISS-PROT蛋白质数据库中查询与该序列所编码的氨基酸最为相似的蛋白。其中，一个序列编码的氨基酸与糜蛋白酶和蚓激酶具有相似的物化性质，即为后来鉴定的沙蚕激酶。
三、结果获得编码沙蚕激酶的核苷酸序列如下atggaggtaactgtgttctctcgctctgaatgtgaaactttttggggcagttccatcaatgatggccatgtctgtgtcggtgtcattggctctgctggtgcctgtaacggagactccggtggccctctggcagcatctgaaaaactggttggcgtgacatcatttggactcagtggatgcttcaccagtcgcccatccgtgtacagcagcattgagaacttcagggagttcatcgacagtgtcatgcaa。
其编码的氨基酸序列为
MEVTVFSRSECETFWGSSINDGHVCVGVIGSAGACNGDSGGPLAASEKLVGVTSFGLSGCFTSRPSVYSSIENFREFIDSVMQ。
实施例2、沙蚕激酶编码基因的原核表达和纯化。
一、材料超声裂解仪(日本)，内切酶EcoRI，BamHI(Promega公司)，GST纯化珠(安玛西亚公司)，凝血酶(Sigma公司)，表达载体PGEX4T-2、宿主菌DH5α为本室保存，1×TSS、IPTG、PBS(PH7.3)。
二、方法1、插入原核表达载体PGEX4T-2中构建重组表达质粒。
根据已经测序的完整核苷酸序列设计表达引物。上游5’-AATGGATCCTATATGGAGGTAACTGTGTTCTCT-3’含有EcoRI酶切位点，下游5’-ATGAATTCTCATTGCATGACACTGTCGATGAA-3’含有BamHI酶切位点。PCR扩增目的片段，将该目的片段利用酶切、连接的方法与表达载体PGEX4T-2相连。
2、转入大肠杆菌工程菌细胞E.coli DH5α诱导表达目的蛋白。转化法将PGEX4T-2/沙蚕激酶转入表达宿主菌DH5α，ALB平板37℃过夜培养后将单个菌落挑起，提取质粒，酶切鉴定获得阳性表达克隆。
3、进行SDS-PAGE电泳初步鉴定表达蛋白的大小。
将重组成功的阳性克隆与液体ALB中活化3-4小时，加入IPTG(终浓度1mM)诱导3小时，诱导后菌体蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定，融合目的蛋白的分子量约为37KD，主要以包涵体形式存在，上清中含量较少。
4、上清中目的蛋白的纯化。
配制凝血酶混合液920μl PBS溶液中加入80μl凝血酶(1unit/μl)。将诱导成功的200ml宿主菌4000g离心15分，收集菌体，经PBS洗涤3次后重悬于5ml PBS中。超声裂解(15s×4次)，10000g离心60分，取上清。加入安玛西亚公司GST纯化珠20μl，室温缓慢震摇(100rpm/min)30分。2000g离心5分钟，PBS洗涤3次。以上述1ml凝血酶混合液重悬结合有目的蛋白的GST纯化珠，室温酶切8-16小时，获得纯化的目的蛋白(因凝血酶不影响相应的溶栓活性，在活性测定前没有去除)。
三、结果获得一阳性表达克隆，融合目的蛋白分子量为37KD，酶切后获得一分子量为9KD的目的蛋白。结果如图1所示，左侧为菌体蛋白，中间为蛋白Marker，右侧为纯化后融合蛋白。
实施例3、生物活性测定一、材料琼脂糖(西班牙)、多美滋脱脂奶粉(丹麦哥本哈根营养乳品有限公司)、纤溶酶原(Sigma公司)、尿激酶(中国绿叶制药)二、方法制作测活平板(1％脱脂奶粉、1％琼脂糖、50u/ml纤溶酶原)将纯化后的蛋白加入测活平板，同时加入尿激酶(100u/ul)做阳性对照。37℃16h后观察脱脂奶粉中酪蛋白溶解情况。
三、结果如图2所示，平板上可观察到溶解酪蛋白形成的半透明环。左侧半透明环为10μl尿激酶(100u/μl)结果，上方为沙蚕激酶(20μl)结果。从图片上我们可以得到以下几点结论1、凝血酶切割后获得的沙蚕激酶具有溶解奶粉中的酪蛋白产生半透明环。虽然较之尿激酶其作用效果小，但是因沙蚕激酶表达后主要以包涵体形式存在，而本实验只是对上清中的沙蚕激酶进行了测活，所以沙蚕激酶有溶解酪蛋白的效果。
2、在加入纤溶酶原的平板上可以观察到溶解酪蛋白形成的半透明环，在进行相同操作的未加入纤溶酶原的奶粉平板上没有溶解现象发生。说明沙蚕激酶是通过激活纤溶酶原起作用，没有直接溶解酩蛋白作用。
序列表<110>北京博泰迪生物工程科技开发有限公司<120>一种具有溶栓活性的沙蚕激酶的编码基因序列及其氨基酸序列<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>249<212>DNA<213>围沙蚕属(Perinereis)<400>1atggaggtaa ctgtgttctc tcgctctgaa tgtgaaactt tttggggcag ttccatcaat60gatggccatg tctgtgtcgg tgtcattggc tctgctggtg cctgtaacgg agactccggt120ggccctctgg cagcatctga aaaactggtt ggcgtgacat catttggact cagtggatgc180ttcaccagtc gcccatccgt gtacagcagc attgagaact tcagggagtt catcgacagt240gtcatgcaa249<210>2<211>83<212>PRT<213>围沙蚕属(Perinereis)
<400>2Met Glu Val Thr Val Phe Ser Arg Ser Glu Cys Glu Thr Phe Trp Gly1 5 10 15Ser Ser Ile Asn Asp Gly His Val Cys Val Gly Val Ile Gly Ser Ala20 25 30Gly Ala Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Ala Ser Glu Lys35 40 45Leu Val Gly Val Thr Ser Phe Gly Leu Ser Gly Cys Phe Thr Ser Arg50 55 60Pro Ser Val Tyr Ser Ser Ile Glu Asn Phe Arg Glu Phe Ile Asp Ser65 70 75 80Val Met Gln
权利要求
1.一种具有溶栓活性的沙蚕激酶的编码基因序列，具有序列表中SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
2.一种具有溶栓活性的沙蚕激酶的氨基酸序列，具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.一种具有溶栓活性的沙蚕激酶的编码基因序列的衍生序列，其特征在于该衍生序列包括新分离的具有如权利要求1所述结构同样基本结构的基因序列及使用体外DNA操作技术通过碱基的置换、插入、缺失获得的该基因序列的各种变构体。
4.一种具有溶栓活性的沙蚕激酶的氨基酸序列的衍生序列，其特征在于该衍生序列与权利要求3所述的具有溶栓活性的沙蚕激酶的编码基因序列的衍生序列向对应，包括在相应蛋白质的氨基酸序列基础上经过单个或多个氨基酸的置换、插入、缺失等形成的各种变构体。
全文摘要
本发明公开了一种具有溶栓活性的沙蚕激酶的编码基因序列及其氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，属于医药生物工程领域。本发明的有益效果是根据本发明的沙蚕cDNA文库沙蚕激酶编码基因的DNA(mRNA)序列，可以从多种沙蚕的cDNA文库中克隆沙蚕激酶编码基因，该编码基因通过基因重组技术，可以在真核表达系统(如酵母细胞或动物细胞)或原核表达系统(如大肠杆菌)中获得重组表达，重组沙蚕激酶具有溶栓生物学活性，是新的基因工程药物。
文档编号A61P9/10GK1590547SQ20031011524
公开日2005年3月9日 申请日期2003年11月24日 优先权日2003年11月24日
发明者王斌, 钱冬萌, 阎志勇 申请人:北京博泰迪生物工程科技开发有限公司