一种天冬氨酸类蛋白酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程技术领域，更具体地涉及一种天冬氨酸类蛋白酶及其编码基 因与应用。
【背景技术】
[0002] 天冬氨酸类蛋白酶(asparticprotease，EC3·4·23)是一种内切型淀粉酶，它的活 性中心由两个催化性天冬氨酸残基组成。它广泛存在于动物，植物，微生物中，是一种工业 酶，在食品，酿酒，饮料，制药等行业中具有广泛应用。目前已经分离并鉴定的120种天冬氨 酸类蛋白酶，从数量上看微生物来源的天冬氨酸类蛋白酶占大多数。微生物中能产生酸性 蛋白酉每的有：Bacillus，Thermomonospor，Acinetobacter，Pseudomonas，Streptomyces， Aspergillus，Penicillus等。目前在工业上大量使用的天冬氨酸类蛋白酶主要来源于枯草 芽抱杆菌属（Bacillussubtilis)，地衣（Bacilluslicheniformis)，黑曲霉 (八8卩6坪；[11118111区61')和米曲霉（八8卩6坪；[111180犷5^&6) 0
[0003]虽然天冬氨酸类蛋白酶的工业应用和微生物的天冬氨酸类蛋白酶已经研究了几 十年，并取得了一定的进展，但是符合工业应用要求的仍然有限。
[0004]近年来，一系列植物微生物天冬氨酸类蛋白酶实现了在大肠杆菌或者在酵母中的 异源表达，如来源于棘孢木霉(Trichodermaasperellum)的天冬氨酸类蛋白酶被克隆到大 肠杆菌中实现了可溶性表达（KaiDoua，ZhiyingWang,RongshuZhang，etal.Cloning andcharacteristicanalysisofanovelasparticproteasegeneAsp55from TrichodermaasperellumACCC30536)，即便如此，还是没有筛选得到适冷的、高效的天冬 氨酸类蛋白酶，因此开发这一类新酶依旧是研究热点。1990年以来不少产蛋白酶的南极低 温菌被分离和鉴定出来，1997年，M.FeniceAL等从南极维多利亚岛上分离出5株都具有蛋白 酶活性的G.pannorumvar.pannorum,其中no· 1显示出了显著的活力，有产业化的应用价值 (参见M.FeniceaLetal. 1997.ProductionofextracellularenzymesbyAntarctic fungalstrains.PolarBiol,17:275-280)。2011年，AbiramyKrishn等再次在南极岛上筛 选到了数株低温下分泌蛋白酶的真菌，其中主要菌种为Geomycespannorum(参见 AbiramyKrishnetal.2011.Extracellularhydrolaseemzymeproductionby soilfungifromKingGeorgeIsland,Antarctic.PolarBiol，34:1535-1542) 〇虽然已知 Geomycespannorum具有客观的蛋白酶活性，但是关于其淀粉酶的基因序列和淀粉序列并没 有报道，且由于该菌培养条件限制，至今还没有分离纯化出其蛋白酶，对其酶学性质也没有 研究。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种天冬氨酸类蛋白酶及其编码基因与应用，从而解决现有 技术中的天冬氨酸类蛋白酶较少符合工业应用要求的缺陷。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0007]根据本发明的一个方面，提供一种天冬氨酸类蛋白酶，所述天冬氨酸类蛋白酶是 如下（a)或(b)的蛋白质：（a)由SEQIDN0:3所不的氣基酸残基序列组成的蛋白质；（b)将 SEQIDN0:3所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且具有天冬氨酸类蛋白酶功能的由(a)衍生的蛋白质。
[0008] 该天冬氨酸类蛋白酶来源于南极低温菌Geomycespannorum(菌种保藏号CCTCC AF2014016)。
[0009]为了便于天冬氨酸类蛋白酶的纯化，可在由SEQIDN0:3限定的氨基酸残基序列 组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0010] 表1
[0012] 本发明还提供一种天冬氨酸类蛋白酶基因，编码如上所述的天冬氨酸类蛋白酶。
[0013] 所述天冬氨酸类蛋白酶基因的碱基序列如下：1)如SEQIDN0:2所示的碱基序列； 或2)在严格条件下可与SEQIDN0:2限定的碱基序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的 DNA分子;或3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA 分子。
[0014] 上述严格条件可为在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1 %SDS的溶液中，在65°C条件下 杂交并洗月旲。
[0015]上述(b)限定的天冬氨酸类蛋白酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生 物表达得到。上述(b)中的淀粉酶的编码基因可通过将SEQIDN0:2的自5'末端第1 -1542位 碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对 的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0016]本发明还提供一种重组质粒，所述重组质粒如上所述的天冬氨酸类蛋白酶基因与 表达载体质粒连接构建而成。
[0017] 所述表达载体质粒是米曲霉表达载体pSKNHG。
[0018]本发明还提供包含如上所述的天冬氨酸类蛋白酶基因的表达盒、转基因细胞或重 组菌。
[0019]优选地，所述重组菌是将上述含有天冬氨酸类蛋白酶基因的重组质粒转入米曲霉 中获得的重组菌。
[0020] 本发明还提供一种制备天冬氨酸类蛋白酶的方法。
[0021] 本发明所提供的制备天冬氨酸类蛋白酶的方法，是发酵培养上述含有天冬氨酸类 蛋白酶基因的重组菌，得到天冬氨酸类蛋白酶。
[0022] 本发明还提供一种如上所述的天冬氨酸类蛋白酶在食品，酿酒，饮料，制药行业中 的应用。
[0023]该天冬氨酸类蛋白酶的最适作用温度为60°C，且在50_70°C仍然保持较高酶活力， 属于中温蛋白酶，在pHl.0~5.0的区间内均具有较好的pH稳定性。
[0024]本发明通过基因工程技术，从南极低温菌Geomycespannorum中扩增得到天冬氨酸 类蛋白酶基因，并将其转入米曲霉中成功实现异源表达。本发明提供的天冬氨酸类蛋白酶 具有较高的最适反应温度，且热稳定性好，具有较好的工业应用前景。
【附图说明】
[0025]图1是本发明纯化的天冬氨酸类蛋白酶的SDS-PAGE图，其中，Μ为蛋白Marker，l为 纯化后的GpAl蛋白；
[0026]图2是Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶的温度曲线；
[0027]图3是Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶的温度耐受性；
[0028]图4是Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶的pH曲线；
[0029]图5是Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶的pH耐·受性。
【具体实施方式】
[0030]以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。
[0031]下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述试剂或耗材，如 无特殊说明，均可通过商业途径获得。实验按《分子克隆：实验室手册》（NewYork:Cold SpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件进行，或按照厂商所建议的条件进 行。
[0032]实施例1天冬氨酸类蛋白酶基因的扩增
[0033] 1.1菌株及其培养
[0034] 从马来西亚大学生物科学学院合作项目中获赠南极低温菌Geomycespannorum(菌 种鉴定NCBI登录号JF20026,已保藏在CCTCC，编号为AF2014016)。
[0035]用无菌水从培养10天的PDA斜面上洗下G.pannorum孢子，接种液体培养基，20°C培 养7天收集菌丝体，用于基因组提取：用牙签接种奶粉固体培养基，20°C培养5天收集菌丝， 用于总RNA提取。
[0036] 1.2基因组提取
[0037]按照Omega真菌基因组提取试剂盒说明书进行操作。
[0038]1.3总RNA提取
[0039] 按照TakaraRNA提取试剂盒说明书进行操作。
[0040]1 · 4cDNA第一链合成
[0041]以抽提的总mRNA为模板，用Takara试剂盒的方法获得cDNA第一链，PCR体系(如表 2和表3所述)及操作步骤如下：
[0042]表2
[0043]
[0044] 65°C保温5min，冰上迅速冷却，向上述反应管中加入
[0045] 表 3
[0047] 42°C45min，95°C5min，冰上冷却。
[0048] 1.5Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶基因的克隆
[0049] 在NCBI上找到另一株Geomycespannorum菌种的天冬氨酸蛋白酶氨基酸序列，该菌 株与本申请所采用Geomycespannorum属于不同种，根据该序列设计正向引物Alf，反向引物 Air。其中：
[0050] Pl〇f:5'ATGCCTTCTTCGGCGGCCGT3'
[0051] P1Or：5'TCAAACAACAATCAACAATC3'
[0052] 表 4
[0054]以1.2获得的基因组为模板，采用表4所示反应体系进行PCR。反应条件为:94°C预 变性4min; 94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环；72°C延伸10min;保存在4 °C。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收，连pMD19-TSimpleVector，菌落PCR验证阳性克 隆送测序，测序由华大基因完成。
[0055]1.6天冬氨酸类蛋白酶cDNA的克隆
[0056]分析1.5得到的天冬氨酸类蛋白酶基因DNA序列，根据保守氨基酸序列以3的倍数 递推，同时结合NCBIBlastX比对结果，找到了可能性最大的起始密码子ATG和终止密码子 丁八八。在密码子上预测网站（111^卩：//1；[111^1.80；1^1^61^7.(3 0111/^61'巧.卩111：1111?81'0叩= programs&subgroup=gfind&topic=fgenesh)，得到了主要可能的内含子，设计0RF的特异 性引物：
[0057] Pl〇f2:5'ATGCCTTCTTCGGCGGCCGT3'
[0058] Pl〇r2:5'TCAAACAACAATCAACAATC3'
[0059]以1·4获得的GeomycespannorumcDNA为模板，采用特异性引物P10f2和P10r2，进 行PCR扩增a-淀粉酶0RF，PCR体系如下表5所示：
[0060]表 5
[0062]反应条件为:94°C预变性4min;94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循 环;72°C延伸lO