专利名称：新型钙蛋白酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的哺乳动物钙蛋白酶CAPN11，其合成方法及其应用。
钙蛋白酶是相关蛋白质的超家族，据证实其中的一些起钙依赖的半胱氨酸蛋白酶的作用。在哺乳动物中鉴定出了八种不同的钙蛋白酶。
钙蛋白酶构成胞内钙依赖性半胱氨酸蛋白酶的一个家族。人们鉴定出的哺乳动物钙蛋白酶同系物的数量不断增加，而且各成员可根据物理结构和推测的性质分成四类。A类，“经典的钙蛋白酶”CAPN1，CAPN2，CAPN3(p-94)；CAPN8(nCL-2)和CAPN9(nCL-4)大约全部皆是具有蛋白酶活性和Ca2+依赖性的。它们由一大小可变的(80kDa)和一不变化的小亚基(30kDa)组成。B和D类的钙蛋白酶，CAPN5(6，15)和CAPN7(8)具有蛋白酶活性，但是很可能是Ca2+非依赖性的，C类的钙蛋白酶，CAPN6，可能不具有蛋白酶活性。钙蛋白酶可根据其表达模式分类，其中CAPN3，CAPN6，CAPN8和CAPN9具有一些组织特异性。钙蛋白酶的功能还不清楚，虽然它们与很多生理过程和病理状态有关(文献17中的综论)。为了弄清它们的功能和进化历程，必须鉴定钙蛋白酶家族成员的总谱。
本发明涉及新型的多肽CAPN11，在SEQ.ID.No.2中公开了其氨基酸序列。
该新的钙蛋白酶CAPN11具有典型的钙蛋白酶特性，包括潜在的蛋白酶和钙结合域。它具有较强局限性的组织分布并主要在睾丸中表达。籍助放射杂交作图(strahlungs-Hybrid-Kartierung)，已将该基因定位在染色体6上指定为p12的区域中。系统发生分析表明，哺乳动物中的CAPN11与CAPN1和CAPN2最密切相关。
然而，推测的CAPN11序列在可获得的钙蛋白酶序列中与鸡钙蛋白酶μ/m具有最大同源性。因此，CAPN11可能是μ/m钙蛋白酶的人体直向进化同源物(orthologon)。此新型钙蛋白酶的发现着重说明了钙蛋白酶家族的复杂性，其成员可根据蛋白酶活性，钙依赖性及组织表达加以区分。
CAPN11基因的cDNA核苷酸序列含有2338个核苷酸(SEQ.-ID.-No.1)。cDNA序列源于单一mRNA，借助侧翼引物由人体睾丸cDNA成功扩增整个推断编码区而获得的。对多个cDNA克隆进行了完全测序，以便排除任何PCR假象。
其中有一个大的开放阅读框，编码具有702个氨基酸的蛋白质(Mr80kDa)(
图1)。氨基酸序列与钙蛋白酶家族成员的大亚基相似(
图1)。该蛋白质可分成四个钙蛋白酶典型性的结构域。结构域II具有蛋白酶结构域的特性，其推测的氨基酸序列具有作为半胱氨酸蛋白酶活性位点部分的三个氨基酸基团(Cys102，His259和Asn283)(2)。对CAPN2报导的所有五个Ca2+结合序列(4，12)的氨基酸序列在一定程度上保守(
图1)。因此，这种蛋白质可能具有蛋白酶特性和钙结合特性。推测的氨基酸序列与全部其它的钙蛋白酶相比表明，它与小鸡钙蛋白酶μ/m具有最大的序列同源性(57.5％)。在哺乳动物钙蛋白酶中，与人体CAPN1具有最大相似性(54.3％同源性)。具有最小相似性的人体钙蛋白酶是CAPN6，其同源性只有18.7％。对应于此cDNA的基因被人类基因命名委员会称为CAPN11。
对全部被鉴定的人体钙蛋白酶的完整氨基酸序列进行了系统发生分析。其结果可将人体钙蛋白酶分成四个主要进化组(图2)。第一组的代表为CAPN5，CAPN6，CAPN7和CAPN8，第二组的代表为CAPN1和CAPN2，第三组的代表为CAPN3和CAPN9，而第四组包括CAPN11。因此，系统发生分析暗示CAPN11可能代表另外的钙蛋白酶亚家族。
通过Northern和RNA斑点印迹分析对人体组织中CAPN11的表达进行了研究。在50种被研究的组织RNA中，CAPN11 mRNA在睾丸中表达最强(图3A)。这种信号的特异性已被Northern印迹分析证实，其对应于大约3kb大的mRNA(图3D)。在胸腺和乳腺中测出了弱得多的信号。但是这个发现的意义并未弄清，因为在通过Northern印迹分析对胸腺RNA进行的进一步研究中，虽然曝光时间较长仍未给出任何信号(图3D，数据未给出)。一种可能的解释是，这种弱信号归咎于与相关mRNA的交叉杂交。因此睾丸是CAPN11的主要表达位置，但我们不能排除该基因在其它尚未研究的组织中表达的可能性。
我们已经确定人体CAPN11基因定位在哪条染色体上。籍助PCR，用对人体CAPN11核苷酸序列特异的引物以及人/啮齿动物体细胞杂交作图板，我们已将该基因定位到染色体6上(Correll细胞文库)。籍助放射杂交作图，使用中等分辨的Stanford-G3板(Research Genefics Inc.)和Stanford Human GenomeCenter(Shgc-www.Stanford.edu)的数据库，已将该基因定位在该染色体上，距离标志物SHGC-32834有5centiray(LOD Score12.87)。这个标记物位于微卫星标记D6S1616(59.6cM)和D6S427(73.9cM)之间的间隔中(7)，该间隔中的一个标记物D6S269按细胞遗传定位在6p12上(5)。因此，CAPN11位于染色体6上p12附近。在此染色体上未定位任何其它的钙蛋白酶基因。
小鸡μ/m钙蛋白酶是欲克隆的钙蛋白酶家族的第一个成员(16)。开始时它被称为m钙蛋白酶但在其它的鸡钙蛋白酶被鉴定出之后被重新分类，它们很可能是哺乳动物μ和m钙蛋白酶的直向进化同源物(18)。但是尚未测定到哺乳动物μ/m钙蛋白酶。由于CAPN11与小鸡μ/m钙蛋白酶的同源性比其它哺乳动物钙蛋白酶的大，它可能是其直向进化同源物。
迄今有五种钙蛋白酶具有一定程度的组织特异性-CAPN3(骨骼肌)，CAPN6(胎盘)，CAPN8(可能是平滑肌)，CAPN9(胃和小肠)和CAPN11(睾丸)。人们已经在睾丸中鉴定出多种蛋白酶，推测它们参与一些过程例如组织重组等(20)，精子发生调控(14)，精子渗入透明带(10)和受精(13)。但是这些活性中有许多与分泌蛋白酶有关，而APN11可能是胞内定位的。在睾丸中它可能参与其它组织中的钙蛋白酶参与的一些过程，例如生殖细胞凋亡(3)或睾丸特异性转录因子的调控。
本发明的另一主题涉及多肽CAPN11用于鉴定能抑制这种多肽酶活性的物质(即所谓的钙蛋白酶抑制剂)的用途，特别是对CAPN11具有选择性的这类钙蛋白酶抑制剂。选择性意味着，这类钙蛋白酶抑制剂抑制CAPN11的活性比抑制其它上面提及的钙蛋白酶更强，优选至少强10倍，更优选强25倍，或更多。CAPN11的酶活性是一种Ca依赖性的蛋白酶活性。
本发明的另一主题涉及一种鉴定可抑制权利要求1多肽的酶活性的化合物的方法，包括(a)将在该化合物存在时CAPN11的酶活性程度与无该化合物存在时CAPN11的酶活性程度进行比较，和(b)选择与无该化合物存在时CAPN11的酶活性相比改变了CAPN11酶活性程度的化合物。
按上面提及的方法鉴定出的抑制性化合物适宜于治疗由于CAPN11活性非生理性提高所致或与此相关的疾病，例如男人的不育症。
这种抑制剂的剂量和治疗方案应通过对其它蛋白酶抑制剂已知的常规方法确定。参考文献1.Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.and Lipman，D.J.(1990).基础局部比对测序工具.J.Mol.Biol.215403-410.2.Berti，P.J and Storer，A.C.(1995).半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶超家族的比对/系统发生.J.Mol.Biol.246273-283.3.Billig，H.，Chun S.Y.，Eisenhauer K.and Hsueh，A.J.(1996).生殖细胞凋亡，激素调节的细胞死亡。Hum.Reprod.Update 2103-117.4.Blanchard，H.，Grochulski，P.，Li，Y.，Arthur，J.S.C.，Davies，P.L.，Elce，J.S.and Cygler，M.(1997).Ca2+结合结构域的结构揭示一种新型的EF手结构以及Ca2+诱导的构象变化。Nature Structural Biology 4532-538.5.Bray-Ward，P.，Menninger，J.，Lieman，T.，Desai，T.，Mokady，N.，Banks，A.and Ward，D.C.(1996).通过CEPH YAC克隆的FISH作图整合人基因组的细胞遗传、遗传和物理图谱。Genomics 321-14.6.Dear，N.，Matena，K.，Vingron，M.and Boehm，T.(1997).缺乏钙调蛋白样结构域的一种新型脊椎动物钙蛋白酶超家族揭示钙蛋白酶的调控和进化。Genomics 45175-184.7.Deloukas，P.et al.(1998).30,000种人类基因的物理图谱。Science282744-746.8.Franz，T.，Vingron，N.，Boehm，T.and Dear，T.N.(1999).Capn7一种具有新型C-末端结构域的高度多样化脊椎动物钙蛋白酶。Mamm.Genome，10318-321.9.Frohman，M.A.，Dush，M.K.and Martin，G.R.(1988).利用单基因特异性引物进行扩增，由稀有转录物快速生产全长cDNA。Proc.Natl.Acad.Sci.USA858998-9002.10.Kohno，N.，Yamagata，K.，Yamada，S.，Kasiwabara，S.，Sakai，Y.andBaba，T.(1998).两种新型睾丸丝氨酸蛋白酶TESP1和TESP2存在于小鼠精子顶体中。Biochem.Biophys.Res.Commun.245658-665.11.Kozak，M.(1996).解译cDNA序列对翻译研究的一些内在认识。Mamm.Genome 7563-574.12.Lin，G.-D.，Chattopadhyay，D.，Maki，M.，Wang，K.K.W.，Carson，M.，Jin，L.，Yuen，P.-W.，Takano，E.，Hatanaka，M.，DeLucas，L.J.andNarayana，S.V.L.(1997).1.9Ai分辨率下钙蛋白酶的钙结合结构域VI的晶体结构，以及它在酶装配、调节和抑制剂结合方面的作用.Nature StructuralBiology 4539-547.13.Mbikay，M.，Tadros，H.，Ishida，N.，Lerner，C.P.，De Lamirande，E.，Chen，A.，El-Alfy，M.，Clermont，Y.，Seidah，N.G.，Chrétien，N.，Gagnon，C.and Simpson，E.M.(1997).睾丸生殖细胞蛋白酶PC4缺陷的小鼠生育力受损。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 946842-6846.14.Monsees，T.K.，Gornig，N.，Schill，W.B.and Miska，W.(1998).精子发生调控中可能涉及蛋白酶.Andrologia 30185-191.15.Mugita，N.，Kimura，Y.，Ogawa，M.，Saya，H.and Nakao，M.(1997).鉴定一种新型组织特异性钙蛋白酶htra-3，Caenorhabditis elegans性别决定基因的人类同系物。Biochem.Biophys.Res.Comm.239845-850.16.Ohno，S.，Emori，Y.，Imajoh，S.，Kawasaki，H.，Kisaragi，M.andSuzuki，K.(1984).通过将巯基蛋白酶与钙结合蛋白融合分析钙依赖型蛋白酶的进化起源。Nature 312566-570.17.Ono，Y.，Sorimachi，H.and Suzuki，K.(1998).钙蛋白酶，一种神秘蛋白酶，的结构和生理学。Biochem.Biophys.Res.Commun.245289-294.18.Sorimachi，H.，Tsukahara，T.，Okada-Ban，M.，Sugita，H.，Ishiura，S.and Suzuki，K.(1995).鉴定第三种遍在钙蛋白酶种类-鸡肌肉中表达四种不同的钙蛋白酶。Biochim.Biophys.Acta 1261381-393.19.Thompson J.D.，Higgins D.G.and Gibson T.J.(1994).CLUSTAL W通过序列加权、位置特异性缺口罚分和重量矩阵选择改善进行性多重序列比对的灵敏度。Nucl.Acids Res.224673-4680.20.Tohonen，V，Osterlund，C.and Nordqvist，K.(1998).Testatin一种在早期睾丸发育过程中表达的半胱氨酸蛋白酶相关基因。Proc Natl.Acad.Sci.USA 9514208-14213.
附1，将CAPN11的推测氨基酸序列与其它人体钙蛋白酶进行分组比较。氨基酸序列的多次分组籍助CLUSTAL W(19)进行。CAPN11推测的起始甲硫氨酸(GGAatgG)相当于翻译起始位点的最小共有序列(RNNatgG，其中R为嘌呤，文献11)。在其它蛋白质中与CAPN11相同的氨基酸用阴影部分表示。虚线表示缺口，将之引入以便使比对最大化。箭头尖指三个保守的氨基酸，它们是钙蛋白酶活性位点的部分。CAPN8的潜在EF-Hand-钙结合结构域用下划线标出，并连续编号。给出了钙蛋白酶的任意结构域。分别只在大鼠和小鼠中鉴定出的CAPN4和CAPN7的序列未表示出来。已公布的CAPN6序列未包括在内，因为它只是部分序列。分组的钙蛋白酶的其它名称和编号数在图2的图例中给出。
图2，人体钙蛋白酶大亚基家族的无根系统发生树。分析用PAUP-程序进行，并使用海德堡德国癌症研究中心的HUSAR服务器中的CLUSTREE排列该树。水平线的长度与衍生的系统发生距离成比例；垂直线无任何意义。进行1000次引导指令(Bootstrapping)重复，其值在内部节点示出。CAPN7序列来源于小鼠，因为只有很少量的人体核苷酸和蛋白质序列可供使用。确实存在人体直向同源物(参见文献8)，因此用小鼠序列作这种比较是合理的。部分人体CAPN8序列是EST克隆AA026030的推测翻译(Hillier等人，1995，The Washu-Merck EST-Projekt，未发表的结果)。这一克隆的氨基酸翻译表现出与大鼠CAPN8序列有高的相似性。对这个序列未进行引导指令法，因为它比其它的短得多。因此，将引导指令值与全长序列比较的值进行比较无太大意义。本文将采用人类基因命名委员会规定的名称汇编。各种钙蛋白酶以前的名称为CAPN1-m钙蛋白酶，CAPN2--m钙蛋白酶，CAPN3-p94，nCL-1，CAPN8，nCL-2，CAPN9，nCL-4，对于所用钙蛋白酶序列的EMBL编号为CAPN1(P17655)，CAPN2(P07384)，CAPN3(P20807)，CAPN5(Y10656)，CAPN6(Y12582)，CAPN7(AJ012475)和CAPN9(AF022799)。
图3是CAPN11的表达。将具有人体CAPN11cDNA编码序列的800碱基对区段的32P-标记DNA探针Master印迹(A)，带50种不同人体组织的RNA斑点印迹的尼龙膜或者Clontech-多组织Northern-印迹(D)上杂交。对膜进行高严谨度(6×SSC，65℃)的洗涤。不同的RNA在斑点印迹膜上的准确位置用图表示(C)。Northern印迹上的RNA在相应的泳道上方给出。斑点印迹和Northern印迹用人遍在蛋白(B)和β-肌动蛋白的DNA探针进行再杂交，以便测定所上样的poly(A+)RNA的量。对于Northern印迹给出了分子量标记物(以千碱基计)的位置。曝光时间为A，72小时.；B，24小时.；D，48小时。PBL＝外周血白细胞。
序列表<110>BASF Aktiengesellschaft<120>Hoden-spezifisches Calpain<120>睾丸特异性钙蛋白酶<130>OZ0050/<140><141><160>2<170>PatentIn Ver. 2.0<210>1<211>2338<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>5′UTR<222>(1)..(103)<220><221>CDS<222>(104)..(2212)<220><221>3′UTR<222>(2213)..(2338)<400>1ctccccaggg ccgagtcttc cggagtcagc agagagcctg gatggatcac aggaggataa 60gcctcggggc tcatgtgcgg agcccacttt tactgatacg gga atg gtg gct cac 115Met Val Ala His1ata aac aac agc cgg ctc aag gcc aag ggc gtg ggc cag cac gac aac 163Ile Asn Asn Ser Arg Leu Lys Ala Lys Gly Val Gly Gln His Asp Asn5 10 15 20gcc cag aac ttt ggt aac cag agc ttt gag gag ctg cga gca gcc tgt 211Ala Gln Asn Phe Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Leu Arg Ala Ala Cys25 30 35cta aga aag ggg gag ctc ttc gag gac ccc tta ttc cct gct gaa ccc 259Leu Arg Lys Gly Glu Leu Phe Glu Asp Pro Leu Phe Pro Ala Glu Pro40 45 50agc tca ctg ggc ttc aag gac ctg ggc ccc aac tcc aaa aat gtg cag 307Ser Ser Leu Gly Phe Lys Asp Leu Gly Pro Asn Ser Lys Asn Val Gln55 60 65aac atc tcc tgg cag cgg ccc aag gat atc ata aac aac cct cta ttc 355Asn Ile Ser Trp Gln Arg Pro Lys Asp Ile Ile Asn Asn Pro Leu Phe
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权利要求
1.具有SEQ.ID.No.2.氨基酸序列的多肽。
2.编码权利要求1的多肽的多核苷酸序列。
3.具有SEQ.ID.No.1序列的多核苷酸序列。
4.权利要求1的多肽用于鉴定能抑制这类多肽酶活性的物质的应用。
5.可抑制权利要求1多肽的酶活性的化合物的鉴定方法，包括(a)将在该化合物存在时CAPN11的酶活性程度与在无该化合物存在时CAPN11的酶活性程度比较，和(b)选择与无该化合物存在时CAPN11的酶活性相比改变了CAPN11酶活性程度的化合物。
6.通过权利要求5的方法鉴定出的化合物对治疗男人生育紊乱的应用。
全文摘要
本发明涉及新型钙蛋白酶及其应用。
文档编号C12N15/09GK1373808SQ00808932
公开日2002年10月9日 申请日期2000年6月7日 优先权日1999年6月18日
发明者N·T·迪尔, T·博姆, A·穆勒 申请人:巴斯福股份公司