一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物育种技术领域，具体涉及一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]红曲霉是发酵行业的功能菌株，其体内含有酸性蛋白酶As/基因，该基因可表达产生酸性蛋白酶Asp，酸性蛋白酶Asp对白酒酿造有以下作用:
1、促进微生物生长:
微生物的发育需要有蛋白质为其提供氮源及能量，在入窖时发酵糟的酸度以及发酵初期窖内酸度较大，此时曲霉中的酸性蛋白酶可强化蛋白质分解为氨基酸，丰富酒醅中氨基酸含量，有利于微生物生长。
[0004]2、提高原材料的利用率:
酸性蛋白酶的应用可强化酒精代谢，使原料出酒率提高。
[0005]3、提供生香前体物质和风味物质:
酸性蛋白酶在酿酒的酸性环境中，将原料蛋白质水解成氨基酸，多种氨基酸是生成白酒香味成分的前体物质，经过不同微生物及酶的代谢，可生成多种香味物质。
[0006]然而，现有技术中，红曲霉的酸性蛋白酶表达量并不高，而酸性蛋白酶酶制剂成本高、活性低，不能广泛应用于生产，因而存在一定的缺陷。有鉴于此，如何获得高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株具有十分重要的意义。为了获得高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株，常见的方法有自然选育法、诱变育种法、基因重组育种法；但自然选育法的工作范围大，诱变育种法具有不定向性且诱变后稳定性低的缺点。
[0007]
【发明内容】
[0008]针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法，使构建得到的红曲霉菌株具有酸性蛋白酶基因高表达量。
[0009]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法，先从红曲霉基因组中扩增红曲霉酸性蛋白酶基因片段，然后将扩增得到的所述Asp片段连接到空载体上构建红曲霉酸性蛋白酶的重组表达载体，将所述红曲霉酸性蛋白酶的重组表达载体转化到根癌农杆菌中得到重组根癌农杆菌，再利用根癌农杆菌介导法将所述重组根癌农杆菌导入红曲霉，得到所述高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株。
[0010]相比现有技术，本发明具有如下有益效果:
1、本发明创造性地从红曲霉基因组中扩增As./基因，利用PBC-Hygr0质粒的强启动子，将红曲霉酸性蛋白酶基因片段与pBC-Hygro载体连接，构建重组载体pBC-Hygro-Asp，再利用根癌农杆菌介导法将As/基因导入红曲霉，筛选出能高产酸性蛋白酶的红曲霉同源转化子菌株，解决了目前红曲霉菌株不具有高产酸性蛋白酶的性质，而且酸性蛋白酶酶制剂成本高、活性低、不能广泛应用于生产的技术问题，具有良好的市场应用前景。
[0011]2、本发明得到的红曲霉转化子菌株酸性蛋白酶基因的表达量是野生型红曲霉酸性蛋白酶基因表达量的3.30倍，能实现酸性蛋白酶的高产，具有转化子菌株在酸性条件下分解蛋白质能力强的特点。
[0012]3、本发明采用基因重组法获得的同源转化子红曲霉菌株，具有高效表达、准确加工、转化子遗传稳定的特点，可以在非选择压力下实现稳定传代，且与异源表达相比，同源表达构建的目的菌株稳定性更强。
[0013]
【附图说明】
[0014]图1为红曲霉酸性蛋白酶PCR反应产物的电泳图；
图2为重组载体pBC-Hygro-As^的构建图谱；
图3为pBC-Hygro空载体和重组载体pBC-Hygro-j^p的电泳图；
图4为重组载体pBC-Hygro-AsT?扩增后的电泳图；
图5为红曲霉转化子菌株的验证图；
图6为在含有潮霉素的麦芽琼脂培养基上接种野生型红曲霉菌株的菌落图；
图7为在含有潮霉素的麦芽琼脂培养基上接种红曲霉转化子菌株的菌落图；
图8为在不含潮霉素的麦芽琼脂培养基上接种红曲霉转化子菌株的菌落图；
图9为在不含潮霉素的麦芽琼脂培养基上接种野生型红曲霉菌株的菌落图；
图10为发酵液中酸性蛋白酶产生的透明圈；
图11为红曲霉酸性蛋白酶基因qPCR结果。
[0015]
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。
[0017]实施例中红曲霉由四川省农科院水稻高粱研究所生物技术中心唐玉明提供；质粒pBC-Hygro由法国P.Silar教授惠赠；红曲霉酸性蛋白酶基因片段由英潍捷基贸易公司合成；高保真酶Pfu DNA聚合酶、T4 DNA连接酶和限制性内切酶Sma I购于Takara公司；真菌RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、质粒小提试剂盒为OMEGA公司产品；氯霉素、潮霉素、头孢噻污钠、庆大霉素、其他常规分析纯试剂以及LB培养基和察氏培养基均购自北京康为世纪科技有限公司。
[0018]一种高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株的构建方法，先从红曲霉基因组中扩增红曲霉酸性蛋白酶基因片段，然后将扩增得到的所述片段连接到空载体上构建红曲霉酸性蛋白酶的重组表达载体，将所述红曲霉酸性蛋白酶的重组表达载体转化到根癌农杆菌中得到重组根癌农杆菌，再利用根癌农杆菌介导法将所述重组根癌农杆菌导入红曲霉，得到所述高产酸性蛋白酶的红曲霉菌株。
[0019]实施例1:红曲霉酸性蛋白酶基因的克隆 1、红曲霉RNA的提取和CDNA双链的合成: 将用麦芽琼脂培养基培养12天的红曲霉菌丝用无菌药匙刮下，液氮研磨后用OMEGA公司的真菌RNA提取试剂盒提取其RNA ;取500 ng提取的红曲霉RNA使用逆转录试剂盒合成第一链和第二链，合成的cDNA双链置于_20°C保存。
[0020]2、引物设计和基因扩增:
根据GenBank中公布的紫红曲霉酸性蛋白酶基因As/K AB090877.1)序列(SEQ IDN0.1)和质粒pBC-Hygro多克隆位点的特征，用软件Primer Premier5.0设计基因引物。引物序列为:
^5/^0RF-F: 5’ -TCCCCCGGGATGGTCGTCTTCAGCAAGATCAC-3’
^5/^0RF-R:5’ -TCCCCCGGGTTATGCCTGAGGGGCAAATCCGA-3’
以I中合成的cDNA为模板，用上述引物PCR扩增得到长度为1200bp左右的特异性条带，如图1所示；图1中M:DL2000 DNA marker, 1-4:红曲霉酸性蛋白酶基因的PCR产物。将目的片段连接到T4载体，转化入大肠杆菌DH5 α，用M13引物鉴定正确后送往测序公司测序，测序后进行Blast比对分析，结果与GenBank AB090877.1序列相似度达100%，表明红曲霉酸性蛋白酶基因被成功克隆。
[0021]实施例2酸性蛋白酶基因红曲霉表达载体PBC-Hygro-As^的构建:
将实施例1测序正确的As./?片段和载体pBC-Hygro分别用Sma I限制性内切酶进行酶切，使用胶回收试剂盒回收和纯化酶切后的As./?和线性pBC-Hygro载体，然后使用T4 DNA连接酶将义印片段克隆到pBC-Hygro载体上；重组表达载体pBC-Hygro- 的构建图谱如图2所示。
[0022]用pBC-Hygro空载体和重组后的表达载体pBC-Hygro-As1/厂起电泳，结果显示重组后的质粒比空质粒载体长1200bp左右，如图3所示，图3中M:DL23130 DNA Marker，I:载体pBC-Hygro-乂印，2