一株红曲霉菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株红曲霉(Monascus?sp.)菌株，其保藏号为CGMCC?No.7603。本发明的红曲霉菌株可以产生天然的红曲色素，能够安全地运用于食品加工工业。本发明的红曲霉菌株已于2013年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
【专利说明】一株红曲霉菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株红曲霉菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 红曲霉（Monascus)是我国最早应用于食品加工的有益真菌之一，其发酵产物红 曲古代称为丹曲，起源于中国，应用历史悠久，主要集中在传统酒曲、制醋、着色等领域，是 药食兼用的传统用材。红曲霉能产生大量的红曲色素，由于红曲色素的安全可靠性，因此被 广泛用作食品着色剂。近年来，还发现红曲中含有多种功能成分，如Monacolin-K、麦角固 醇、氨基丁酸、天然植物激素等，因此具有极高的营养、保健和药用价值。现代科学家研 究结果也表明，红曲具有降低血胆固醇、降血糖、降血压和防癌等功效。
[0003] 通常霉菌奶酪主要为白霉干酪和蓝纹干酪，如卡门培尔干酪（Camembert)和布里 蓝乳酪（Blue Brie)。到目前为止，还鲜有将红曲霉菌用于制备干酪的研究。因此，应用红 曲霉生产干酪将是一个新的研究领域，红曲霉色素可以赋予干酪新的色泽，将打破人们对 传统霉菌干酪颜色认知的界限，同时赋予干酪更高的营养价值，除此以外，红曲霉可有效地 改善干酪中由于酮和脂肪酸比例过高带来的不易让人们接受的风味。
[0004] 但到目前为止，还没有成功应用于生产干酪的红曲霉菌株的报道，此现状亟待改 变。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对目前本领域尚无成功应用于生产干酪的红曲 霉菌株的现状，而提供一株红曲霉菌株及其应用。本发明的红曲霉（Monascus sp.)GL-l菌 株是从我国湖北武汉的红曲米粉中分离而得，可以产生天然的红曲色素，该株红曲霉菌已 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 7603,目前并 没有将其应用于干酪中的报道。本发明 申请人:将其用于制备干酪，取得了非常好的效果，其 对改善干酪的外观、质构和口感具有积极贡献。
[0006] 本发明提供的技术方案之一是：一株红曲霉（Monascus sp.)菌株，其保藏号为 CGMCC No. 7603。
[0007] 本发明的红曲霉菌株由本发明 申请人:从我国湖北武汉的红曲米粉中首次分离获 得，可以产生天然的红曲色素，能够安全地运用于食品加工工业。本发明的红曲霉菌株已于 2013年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，命名为 Monascus sp.GL_l〇
[0008] 本发明的红曲霉菌株经24h培养后，菌落初呈烟白色，之后迅速生长，3d后呈紫红 色，菌落大而紧密。菌丝具有横隔多核，分枝甚繁，分生孢子着生在菌丝及其分枝顶端，单生 或成链，闭囊壳呈球形，有柄，内有10多个球形子囊，子囊内有子囊孢子，其形态特征符合 红曲霉属的特征。
[0009] 本发明提供的技术方案之二是：前述保藏号为CGMCC No. 7603的红曲霉菌株的培 养方法，其包括步骤：将红曲霉菌株接种于液体培养基后于15?35°C培养3?10天，所述 液体培养基选自PDA液体培养基、YES液体培养基和Μ液体培养基中的任一种。
[0010] 其中，所述的PDA液体培养基、YES液体培养基和ΜΑ液体培养基的配方如本领域 常规所指。优选地，所述的PDA液体培养基包括6g/L马铃薯浸粉和20g/L葡萄糖，或者，所 述的PDA液体培养基也可以为经过改良的PDA液体培养基，其包括30?40g/L葡萄糖、3? 5g/L蛋白胨、0· 5?lg/L MgS04和0· 5?lg/L Κ2ΗΡ04 ;所述的YES液体培养基包括5g/L酵 母浸粉、30g/L葡萄糖、6g/L磷酸二氢钾、4g/L磷酸二氢钠和lg/L氢氧化铵；所述的MA液 体培养基包括25g/L麦芽浸膏。
[0011] 本发明中，较佳地，在培养期间，对培养体系进行搅拌或震荡。所述震荡的条件优 选 100 ?180rpm，最优选 150rpm。
[0012] 本发明中，将红曲霉菌株接种于液体培养基后较佳地于20?30°C培养5?10天。
[0013] 本发明中，所述的培养方法在前述步骤之前还包括固体培养的步骤：将冻存的 红曲霉菌株缓慢升温至〇°C?35°C，取融化的菌液在固体培养基上涂布或划线，之后置于 15?35°C培养5?10天，所述的固体培养基选自PDA固体培养基、YES固体培养基和MA固 体培养基中的任一种。
[0014] 所述的PDA固体培养基、YES固体培养基和MA固体培养基的配方如本领域常规所 指。优选地，所述的PDA固体培养基包括6g/L马铃薯浸粉、20g/L葡萄糖和20g/L琼脂，或 者，所述的PDA固体培养基也可以为经过改良的PDA固体培养基，其包括30?40g/L葡萄 糖、3?5g/L蛋白胨、0· 5?lg/LMgS04、0. 5?lg/L Κ2ΗΡ04和20g/L琼脂；所述的YES固体 培养基包括5g/L酵母浸粉、30g/L葡萄糖、6g/L磷酸二氢钾、4g/L磷酸二氢钠、1 g/L氢氧化 铵和20g/L琼脂；所述的Μ固体培养基包括25g/L麦芽浸膏和12-20g/L琼脂。
[0015] 其中，所述的将冻存的红曲霉菌株缓慢升温至〇°C?35°C是为了便于后续的涂布 或划线培养，优选升温至15?35°C。在所述涂布或划线后，优选置于25?32°C培养6? 8天，最优选置于28°C培养7天。
[0016] 本发明提供的技术方案之三是：前述保藏号为CGMCC No. 7603的红曲霉菌株在制 备干酪中的应用。
[0017] 本领域技术人员应当理解，该菌株同样可以用于除制备干酪以外的其他食品加工 工艺中。
[0018] 本发明所用试剂和原料除特别说明之外，均市售可得。
[0019] 本发明的积极进步效果在于：本发明公开了一株新的红曲霉菌株，其是保藏号为 CGMCC No. 7603的红曲霉（Monascus sp. )GL-1菌株，其几乎不产橘霉素，且拥有较高的色 价，可用于制备干酪或者其他的食品加工工艺中。
[0020] 牛物材料保藏信息
[0021] 本发明提供的红曲霉（Monascus sp. )GL_1菌株，已于2013年5月8日保藏在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo. 7603,培养物名称是红曲霉GL-1，分类命名 是红曲 Monascus sp.
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为红曲霉生长一周后活菌数量的测定数据，横坐标为各菌株的编号，纵坐标 为活菌的数量。
[0023] 图2为不同红曲霉菌产桔霉素的测定数据，横坐标为各菌株的编号，纵坐标为桔 霉素的产量。
[0024] 图3为不同红曲霉菌产色素色价的测定数据，横坐标为各菌株的编号，纵坐标为 色价。
【具体实施方式】
[0025] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0026] 下述实施例中，部分试剂或原料的来源如下：
[0027] 发酵剂：R_704,科·汉森有限公司产品；
[0028] 凝乳酶：包括小牛胃凝乳酶和微生物凝乳酶，科?汉森有限公司产品（Fromase 750XLG)；
[0029] 其余试剂或原料如无特殊说明，均为常规市售途径可得。
[0030] 实施例1菌株的分离和保藏
[0031] 样品来源：我国湖北武汉的红曲米粉。
[0032] 培养基成分：马铃薯浸粉6g/L，葡萄糖20g/L。
[0033] 仪器设备：高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台。
[0034] 1、分离纯化步骤如下（采用稀释涂布平板法）：
[0035] (1)配置固体培养基（包括固体培养皿和试管斜面）：马铃薯浸粉6g/L，葡萄糖 20g/L，琼脂 20g/L，pH 值 5. 6 (25°C )。
[0036] (2)稀释样品：采用无菌水对样品进行梯度稀释，分别稀释至10'1(Γ6和10Λ
[0037] (3)涂布培养：取各个稀释度0. 5ml样品加入到各固体培养基平板中，进行涂布。 均匀涂布后于32-34°C在恒温培养箱内培养5-6天。
[0038] (4)纯化培养：选取红色较纯、生长迅速、菌体健壮的菌株转接于试管斜面培养基 上，进一步对其纯化，再经反复多次分离、纯化，最后得到最理想的1株菌株，编号GL-1。在 GL-1的分离纯化过程中，还同时得到其他几株菌株，分别编号为GL-2、GL-3、BD-7和BD-11。
[0039] 2、菌种保藏：将所得的GL-1菌株于2013年5月8日保藏于中国普通微生物菌种 保藏管理中心化61?：〇，保藏号为0610：吣.7603，命名为红曲（]\1〇1^8(3118 8口.）61^-1。
[0040] 实施例2菌株特性
[0041] 1、形态特征鉴定：通过培养观察，GL-1经24h培养菌落初呈烟白色，之后迅速生 长，3d后呈紫红色，菌落大而紧密。菌丝具有横隔多核，分枝甚繁，分生孢子着生在菌丝及其 分枝顶端，单生或成链，闭囊壳呈球形，有柄，内有10多个球形子囊，子囊内有子囊孢子，其 形态特征符合红曲霉属的特征。
[0042] 2、菌株培养特性：经过培养发现，GL-1菌株的固体培养和液体培养在15?35°C 均能进行，比较合适的生长温度为25?32°C，最适温度为28°C。合适的生长培养基可以是 PDA培养基、YES培养基或者MA培养基，其中，PDA培养基、YES培养基或者MA培养基的配 方可以是普通所指，优选的配方如下（液体培养基）：所述的PDA培养基包括6g/L马铃薯 浸粉和20g/L葡萄糖，或者，所述的PDA培养基包括30?40g/L葡萄糖、3?5g/L蛋白胨、 0· 5?lg/L MgS04和0· 5?lg/L Κ2ΗΡ04 ;所述的YES培养基包括5g/L酵母浸粉、30g/L葡 萄糖、6g/L磷酸二氢钾、4g/L磷酸二氢钠和lg/L氢氧化铵；所述的Μ培养基包括25g/L麦 芽浸膏。若要使用固体培养基，在液体培养基的基础上添加20g/L琼脂即可。
[0043] 3、与其他红曲霉的比较试验：将红曲霉菌株GL-1与其他几株红曲霉菌株GL-2、 GL-3、BD-7、BD-11及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为3. 5834的 红曲霉菌株进行对比，分别测定了菌株的生长情况、产毒素（桔霉素）的情况和色价，结果 分别如图1、图2和图3所示。具体的实验操作如下：
[0044] (1)生长情况测定：将不同编号的红曲霉接种于YES(Yeast extract with supplements)培养基中进行培养，在17°C下培养一周后计数。根据王昌禄等人的研究方法 (王昌禄，张晓伟，陈勉华，等."红光对红曲霉生长及次级代谢产物的影响" [J].天然产物 研究与开发，2009, 21:91-95.)，测定菌丝重量，表示其生长状况。从图1可以看出，本发明 的红曲霉菌株GL-1相比其他菌株菌丝重量最大，与其他菌株有显著性差异，在17°C环境下 具有明显的生长优势，特别适合于制备干酪。
[0045] (2)产桔霉素：将不同编号的红曲霉接种于YES培养基中，28°C下培养5天，根据 许赣荣的测定方法（许赣荣.红曲桔霉素的检测及发酵控制技术[D].江南大学博士论 文，2004.)，采用Agilent HPLC 1260进行测定，结果如图2所示。由图2可以看出，红曲霉 GL-1产桔霉素量几乎为零，产毒素最少，适合于制备干酪。
[0046] (3)将不同编号的红曲霉接种于YES培养基中，28°C下培养5天，根据许赣荣的测 定方法，取适量发酵液用70%乙醇萃取30min，过滤，滤液进行适当稀释后，于190-700nm波 长范围内扫描。色价的计算公式：色价（CV) = 0D505X稀释倍数（U/ml)。结果如图3所 示。由图3可以看出，GL-1产红曲色素的色价最高，说明产红曲霉色素的能力最强。
[0047] 实施例3红曲霉（Monascus sp. )GL_1菌株在干酪制备中的应用
[0048] 本实施例所用配料：鲜牛乳50L，发酵剂R_7041g，小牛胃凝乳酶0. 5g，冻存红曲霉 (Monascus sp. )GL_1，食盐 1. 3kg，葡萄糖 40g，蛋白胨 5g，MgS040. 5g，Κ2ΗΡ040· 5g。
[0049] 制备步骤：
[0050] (1)取50L鲜牛乳过滤除杂质后，于72°C灭菌2min，然后冷却至28°C，得处理乳。 往所述处理乳中接种发酵剂R-704,接种量为lg/50L，于28°C恒温下培养至pH为6. 5时加 入〇. 5g小牛胃凝乳酶，凝乳30min得凝乳；
[0051] (2)将步骤⑴所得的凝乳切割成块状，搅拌lOmin排乳清；待排出乳清后往凝乳 中加入2. 5%的食盐，所述百分比为所述盐占所述凝乳的质量百分比，搅拌均匀后入方形模 亘. ，N 9
[0052] (3)凝乳入模后在模具上放一小桶水（约1. 0公斤）压制并定期翻转5次，频率为 15?30min/次，持续12h，使乳清进一步排出；
[0053] (4)将步骤⑶压制所得的凝乳切割成1. 5cmX3cmX6cm的凝乳块，往凝乳块表面 均勻喷洒厚度约为1mm的红曲霉发酵液，装入成熟容器，恒温培养箱成熟；
[0054] 其中，所述红曲霉发酵液由下述方法制得：将红曲霉（Monascus sp. )GL_1提前 两天接种于红曲霉培养基中，所述红曲霉培养基的配方为：葡萄糖40g/L，蛋白胨5g/L， MgS040. 5g/L，K2HP040. 5g/L ;所述成熟的温度为：初期20°C，中后期16°C ;所述成熟的温度 为：初期2周，中后期2周。
[0055] 实施例4红曲霉（Monascus sp. )GL_1菌株在干酪制备中的应用
[0056] 本实施例所用配料：鲜羊乳50L，发酵剂R-7040. 3g，微生物凝乳酶lg，冻存红曲霉 (Monascus sp. )GL_1，食盐 lkg，葡萄糖 40g，蛋白胨 5g，MgS040. 5g，Κ2ΗΡ040· 5g。
[0057] 制备步骤：
[0058] (1)取50L鲜羊乳过滤除杂质后，于72°C灭菌5min，然后冷却至35°C，得处理乳。 往所述处理乳中接种发酵剂R-704,接种量为0. 3g/50L，于34°C恒温下培养至pH为6. 0时 加入lg微生物凝乳酶，凝乳40min得凝乳；
[0059] (2)将步骤（1)所得的凝乳切割成块状，搅拌lOmin排乳清；待排出乳清后往凝 乳中加入1%的食盐，所述百分比为所述盐占所述凝乳的质量百分比，搅拌均匀后入方形模 亘. ，N 9
[0060] (3)凝乳入模后在模具上放一小桶水（约1. 0公斤）压制并定期翻转8次，频率为 15?30min/次，持续12h，使乳清进一步排出；
[0061] (4)将步骤⑶压制所得的凝乳切割成1. 2cmX3cmX5cm的凝乳块，往凝乳块表面 均匀喷洒厚度约为2_的红曲霉发酵液，装入成熟容器，恒温培养箱成熟；
[0062] 其中，所述红曲霉发酵液由下述方法制得：将红曲霉（Monascus sp. )GL_1提前 三天接种于红曲霉培养基中，所述红曲霉培养基的配方为：葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L， MgS04lg/L，K2HP04lg/L ;所述成熟的温度为：初期22°C，中后期15°C ;所述成熟的温度为：初 期2周，中后期3周。
[0063] 实施例5红曲霉（Monascus sp. )GL_1菌株在干酪制备中的应用
[0064] 本实施例所用配料：鲜马乳50L，发酵剂R_7041g，小牛胃凝乳酶0. 7g，冻存红曲霉 (Monascus sp. )GL_1，食盐 1. 5kg，葡萄糖 40g，蛋白胨 5g，MgS040. 5g，Κ2ΗΡ040· 5g。
[0065] (1)取50L鲜马乳过滤除杂质后，于75°C灭菌2min，然后冷却至35°C，得处理乳。 往所述处理乳中接种发酵剂R-704,接种量为lg/50L，于28°C恒温下培养至pH为6. 0时加 入〇. 7g小牛胃凝乳酶，凝乳30min得凝乳；
[0066] (2)将步骤（1)所得的凝乳切割成块状，搅拌lOmin排乳清；待排出乳清后往凝 乳中加入3%的食盐，所述百分比为所述盐占所述凝乳的质量百分比，搅拌均匀后入方形模 亘. ，N 9
[0067] (3)凝乳入模后在模具上放一小桶水（约L 0公斤）压制并定期翻转7次，频率为 15?30min/次，持续15h，使乳清进一步排出；
[0068] (4)将步骤⑶压制所得的凝乳切割成1. 2cmX3cmX6cm的凝乳块，往凝乳块表面 均匀喷洒厚度约为2_的红曲霉发酵液，装入成熟容器，恒温培养箱成熟；
[0069] 其中，所述红曲霉发酵液由下述方法制得：将红曲霉（Monascus sp. )GL_1提前 三天接种于红曲霉培养基中，所述红曲霉培养基的配方为：葡萄糖40g/L，蛋白胨5g/L， MgS040. 5g/L，K2HP040. 5g/L ;所述成熟的温度为：初期22°C，中后期17°C ;所述成熟的温度 为：初期3周，中后期2周。
[0070] 实施例6红曲霉（Monascus sp. )GL_1菌株在干酪制备中的应用
[0071] 本实施例所用配料：鲜驼乳50L，发酵剂R-7040. 8g，小牛胃凝乳酶0. 5g，1株冻存 红曲霉（Monascus sp. )GL_1，食盐 lkg，葡萄糖 40g，蛋白胨 5g，MgS040. 5g，K2HP040. 5g。
[0072] (1)取50L鲜马乳过滤除杂质后，于75°C灭菌2min，然后冷却至32°C，得处理乳。 往所述处理乳中接种发酵剂R-704,接种量为0. 8g/50L，于30°C恒温下培养至pH为6. 0时 加入0. 5g小牛胃凝乳酶，凝乳40min得凝乳；
[0073] (2)将步骤⑴所得的凝乳切割成块状，搅拌lOmin排乳清；待排出乳清后往凝 乳中加入4%的食盐，所述百分比为所述盐占所述凝乳的质量百分比，搅拌均匀后入方形模 亘. ，N 9
[0074] (3)凝乳入模后在模具上放一小桶水（约L 0公斤）压制并定期翻转10次，频率 为15?30min/次，持续10h，使乳清进一步排出；
[0075] (4)将步骤⑶压制所得的凝乳切割成1. 5cmX3cmX6cm的凝乳块，往凝乳块表面 均匀喷洒厚度约为1. 5_的红曲霉发酵液，装入成熟容器，恒温培养箱成熟；
[0076] 其中，所述红曲霉发酵液由下述方法制得：将红曲霉（Monascus sp. )GL_1提前 三天接种于红曲霉培养基中，所述红曲霉培养基的配方为：葡萄糖40g/L，蛋白胨5g/L， MgS040. 5g/L，K2HP040. 5g/L ;所述成熟的温度为：初期22°C，中后期15°C ;所述成熟的温度 为：初期3周，中后期2周。
[0077] 对比例1
[0078] 现以常用霉菌干酪中的白霉干酪为对比例与前述实施例3?6进行对比。
[0079] 本对比例所用配料：生牛乳50L，发酵剂R_7041g，小牛胃凝乳酶0. 5g，白地霉 (Geotrichum candidum) 50303(购自丹尼斯克公司）5g，食盐 1.3kg。
[0080] 制备步骤与实施例3相同，仅仅是在步骤（4)中往凝乳块表面均匀喷洒厚度约为 1mm的白地霉菌液。
[0081] 其中，所述白地霉菌液由下述方法制得：取白地霉（Geotrichum candidum)菌粉 5g，与水配置成5%。浓度的白地霉菌液。
[0082] 效果实施例1感官测评
[0083] 根据国标GB25192-2010和GB5420-2010综合制定的霉菌干酪感官评定标准如表 1所示。对实施例3?6制备的红曲霉干酪和对比例1制备的白霉干酪进行按照表1的标 准进行感官评定，结果如表2所示：
[0084] 表1霉菌干酪感官评定标准
[0085]
【权利要求】
1. 一株红曲霉（Monascus sp.)菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No. 7603。
2. 保藏编号为CGMCC No. 7603的红曲霉菌株的培养方法，其特征在于，其包括步骤：将 红曲霉菌株接种于液体培养基后于15?35°C培养3?10天，所述液体培养基选自PDA液 体培养基、YES液体培养基和Μ液体培养基中的任一种。
3. 如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的PDA液体培养基包括6g/L马铃 薯浸粉和20g/L葡萄糖，或者，所述的PDA液体培养基包括30?40g/L葡萄糖、3?5g/L蛋 白胨、0. 5?lg/L MgS04和0. 5?lg/L Κ2ΗΡ04 ;所述的YES液体培养基包括5g/L酵母浸粉、 30g/L葡萄糖、6g/L磷酸二氢钾、4g/L磷酸二氢钠和lg/L氢氧化铵；所述的Μ液体培养基 包括25g/L麦芽浸膏。
4. 如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，在培养期间，对培养体系进行搅拌或震 荡。
5. 如权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述震荡的条件为100?180rpm，最优 选 150rpm〇
6. 如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，将红曲霉菌株接种于液体培养基后于 20?30°C培养5?10天。
7. 如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的培养方法在所述步骤之前还包 括固体培养的步骤：将冻存的红曲霉菌株缓慢升温至〇°C?35°C，取融化的菌液在固体培 养基上涂布或划线，之后置于15?35°C培养5?10天，所述的固体培养基选自PDA固体培 养基、YES固体培养基和MA固体培养基中的任一种。
8. 如权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述的PDA固体培养基包括6g/L马铃 薯浸粉、20g/L葡萄糖和20g/L琼脂，或者，所述的PDA固体培养基包括30?40g/L葡萄糖、 3?5g/L蛋白胨、0· 5?lg/L MgS04、0. 5?lg/L Κ2ΗΡ04和20g/L琼脂；所述的YES固体培 养基包括5g/L酵母浸粉、30g/L葡萄糖、6g/L磷酸二氢钾、4g/L磷酸二氢钠、1 g/L氢氧化铵 和20g/L琼脂；所述的Μ固体培养基包括25g/L麦芽浸膏和12-20g/L琼脂。
9. 如权利要求7所述的培养方法，其特征在于，将冻存的红曲霉菌株缓慢升温至15? 35°C ;和 / 或， 在所述涂布或划线后置于20?30°C培养6?8天。
10. 如权利要求1所述的红曲霉囷株在制备干酿中的应用。
【文档编号】A23C19/032GK104099256SQ201410386854
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年8月7日 优先权日:2013年8月7日
【发明者】焦晶凯, 刘振民, 莫蓓红, 郑远荣, 石春权, 凌勇飚, 夏永军 申请人:光明乳业股份有限公司