一种固定化蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于固定蛋白的化合物以及一种用于固定蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 将蛋白固定到如微阵列、芯片和珠等固体载体上是一种用于阐明蛋白-蛋白或蛋 白-配体相互作用以及用于以高处理量的方式探测新蛋白功能的强大方法。不同于DNA微 阵列的情况，由于在实现将蛋白选择性地且均匀取向地分布到固体表面中的固有困难，实 施用于蛋白固定的通用方法存在着挑战。
[0003] 常规固定方法主要依赖三种机理：物理连接、共价键合和生物亲和性固定。然而非 选择性的物理连接或共价键合可能阻塞活性部位或甚至使蛋白变性。通过重组融合标签和 所偶联蛋白的共表达进行固定可以相应保证蛋白的确切取向并且提供了微调生物结合物 拓扑结构的灵活性。例如，将sjGST标签固定到GSH-结合的聚合物珠或将His-标签固定 到Ni-NTA芯片或将生物素-标签结合到链霉亲和素涂布的固体载体上已经被广泛地选作 非共价蛋白固定方法用于保持所标签蛋白的活性。
[0004] 因此开发一种有效且稳定的固定蛋白的策略，能够最大限度地保持活性，是有着 显著意义和应用价值。位置选择性共价固定蛋白最近引起很多关注，因为它能够稳定地、均 匀地且高密度地固定各种蛋白。其方法是将所关注的蛋白与标签蛋白共表达，再利用后者 与其被固定的底物分子共价地且选择性地反应。比如，Kindermann等报道了一种通过不可 逆地将06-苄基鸟嘌呤衍生物的烷基连接到hAGT半胱氨酸残基之一来固定hAGT-标签的 共价方法。
[0005] GST-标签蛋白具有高底物亲合性，然而，已知的GST标签固定方法仍然基于可逆 的GSH-GST结合，限制了它们的应用。
[0006] Viswanathan等报道了通过铜（I)-催化的Huisgen[3+2]环加成反应（"click" 反应）将在C-末端半胱氨酸残基上，用炔改性的GST蛋白共价固定到玻璃表面上的策略。 尽管实现了共价和定向结合，但是铜催化剂可引起某些不稳定的蛋白的变性或沉淀，因此 有可能在固定后降低了蛋白活性。另外，相比于传统的GSH-GST方法，将炔基团引入GST蛋 白是耗时的且高成本的。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一类小分子物质，其能够通过位置选择性共价键合的方式 共价固定蛋白，特别是sjGST-标签化的蛋白。
[0008] 本发明的目的还在于提供一类能够以相对简单的方法合成的具有氟磺酰基的小 分子，当用它们处理sjGST-标签化的蛋白时能够共价地、选择性地、不可逆地标记sjGST。
[0009] 具体来说，本发明提供了下述技术方案：
[0010] 技术方案1.式I的化合物：
[0011]
[0012] 其中，
[0013] 1^是苯基的任选取代基；
[0014] 是Ar的任选取代基；
[0015] m 是 0、1、2、3、4;
[0016] η 是 0、1、2、3、4;
[0017] 连接基团是任选被取代的，并且是由下述Α组中的0-15个和下述Β组中的一个组 成的三价基团，
[0018] A 组：一0 -、一 NH -、一 S -、一 S0 -、一 S02-、一 CO -、一 C ( = NH)-、 -c ( = S) -、一 C ( = SO) -、一 C ( = S02) -、一 Ci 10 亚烷基一、一c 3 10 亚环烷基一、与 一（3-10)兀亚杂环烷基一，
[0019] B组：一N_、一 Q i。次烷基_、一 C3 i。次环烷基_、与一（3_10)兀次杂环烷基_ ;
[0020] Ar是苯、萘、单环杂芳基、双环杂芳基；
[0021] R 选自：
[0022] 可与固体表面反应的基团，包括但不限于氨基（NH2)，羟基（0H)，巯基（SH)，羧基 (C00H)；
[0023] 焚光团（fluorophore);
[0024] 生物素部分；
[0025] _C。丨。亚烷基-C Ξ CH ;和
[0026] 氢。
[0027] 技术方案2 :根据上述技术方案中任一个的化合物，其中所述式I是下述式II :
[0028]
[0029] 技术方案3 :根据上述技术方案中任一个的化合物，其中所述连接基团选自：
[0030]
[0031] 技术方案4:根据上述技术方案中任一个的化合物，其中所述4^〇?丄是
[0032] 技术方案5 :选自下列的化合物：
[0034] 技术方案6. -种固定蛋白的方法，包括下述步骤：
[0035] 步骤1 :通过共价或非共价相互作用，将权利要求1-N中任一项的化合物接枝到固 体表面；和
[0036] 步骤2 :通过在酪氨酸残基的共价键，将蛋白固定到步骤1中制备的固体表面上；
[0037] 或者
[0038] 步骤1 :通过在酪氨酸残基的共价键，使权利要求1-N中任一项的化合物与蛋白反 应；和
[0039] 步骤2 :通过共价或非共价相互作用，将步骤1中制备的蛋白接枝到固体表面。
[0040] 技术方案7 :根据技术方案6的方法，其中所述固体表面包括金属、聚合物或纳米 材料的表面。
[0041] 技术方案8 :根据技术方案6或7的方法，其中所述共价或非共价相互作用包括生 物素-链霉亲和素相互作用或抗原-抗体相互作用。
[0042] 技术方案9 :根据技术方案6、7或8的方法，其中所述酪氨酸残基是日本血吸虫谷 胱甘肤S-转移酶的酪氨酸-ill残基。
【附图说明】
[0043] 图1 :通过融合的GST标签蛋白的位置选择性共价固定，其中sjGSTJDB ID :1M9A。
[0044] 图2 : (A) G「H和G「炔的化学结构；(B)重组s jGST蛋白的G「炔标记（每个条带 〇. 5yg):荧光扫描（FL，上部）；考马斯蓝着色（CBB，下部）；(〇在⑶中的荧光带的密度 测定。
[0045] 图3 :添加不同浓度的G「H的竞争试验：(A)在G「炔处理前和⑶在G「炔处理 后（sjGST，每个条带0.5yg)。
[0046] 图4 :MALDI-T0F-MS显示酪氨酸-111作为Gi化合物的结合位点。（A)在胰蛋白 酶消化后在G^H和Gi-炔处理的sjGST肽之间检测出52道尔顿的质量偏移。（B)MS/MS分 析，在1093和1145处的峰。（C)Y111F sjGST突变体消灭了 Gf炔所造成的标记。
[0047] 图5 : (Α)Α-生物素的化学结构。（B)在匕-生物素预处理的、链霉亲和素-涂布 的96-孔微板上的GST-eGFP固定。（C)用渐增量的Gi-生物素捕获GST-eGFP的结果（更 多GST-eGFP被捕获）。（D)用渐增量的Gi-Η预培养GST-eGFP逐渐使固定减弱。
[0048] 图6 : (A)G「H固定的琼脂糖凝胶珠的结构。⑶和（C)可溶性（青色，位置靠上） 和固定的（绿色，位置靠下）激酶ITK和EGFR的基于HTRF的酶活性实验结果。 具体实施方案
[0049] 缩略语：
[0050] ACN 乙腈
[0051] ATP 三磷酸腺苷
[0052] Beads 珠/高分子球
[0053] Biotin 生物素
[0054] Boc 叔丁基氧羰基
[0055] DCM 二氯甲烷
[0056] DEAD 偶氮二甲酸二乙酯
[0057] DMF 二甲基甲酰胺
[0058] DMS0 二甲基亚砜
[0059] EDTA 乙二胺四乙酸
[0060] eGFP 增强绿色荧光蛋白
[0061] EGFR 表皮生长因子受体
[0062] GfAlkyne G!-块
[0063] Gfbiotin Gf 生物素
[0064] GFP 绿色荧光蛋白
[0065] GSH 谷胱甘肽
[0066] GST 谷胱甘肤S-转移酶
[0067] 1-[双（二甲基氨基）亚甲基]-1H-1，2, 3-三唑并[4, 5-b]吡啶鑰
[0068] HATU 3-氧化物六氟磷酸盐，
[0069] 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1, 2, 3-triazolo[4, 5~b]
[0070] pyridinium3-〇xid hexafluorophosphate
[0071] HEPES 4-羟乙基哌嗪乙磺酸
[0072] His (多聚）组氨酸
[0073] HTRF 均匀时间分辨荧光
[0074] IAYSK
[0075] ITK 可诱导的T细胞激酶
[0076] MALDI-T0F-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
[0077] MS
[0078] MeCN 乙腈
[0079] NsCl 邻硝基苯磺酰氯
[0080] 2-Nitrobenzenesulfonyl chloride
[0081] NTA 次氮基三乙酸
[0082] PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0083] PBS 磷酸盐缓冲液
[0084] Ph 苯基
[0085] PhSH 硫代苯酚
[0086] SDS 十二烷基硫酸钠
[0087] SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0088] sjGST 日本血吸虫谷胱甘肤S-转移酶
[0089] TAMRA 四甲基罗丹明
[0090] TAMRA-N3 四甲基罗丹明-叠氮
[0091] Tetramethylrhodamine 5_Carboxamid〇-(6-Azidohexanyl)
[0092] TBTA 叔丁基2, 2, 2-三氯亚氨逐乙酸酯
[0093] TEA 三乙胺
[0094] TFA 三氟乙酸
[0095] THF 四氢呋喃
[0096] TK T细胞激酶
[0097] TLC 薄层色谱法
[0098] TMS 四甲基硅烷
[0099] 定义
[0100] 根据本发明，札和1?2是任选的取代基，其彼此独立地选自卤素如F-、Cl-、Br-和 1-，NH 2-、CN-，0H-，HS-，-N02, -CF3, -C00H，CH3C0-，（C! 1Q烷基）-C00-，-0-C 丨 1Q烷基，C 丨 10烷 基-、C2 i。烯基-、C 2 i。炔基-、单环或双环的C 3 i。环烷基-、芳基-、单环或双环杂芳基-、芳 基-二价连接基团-芳基_、单环或双环杂芳基-二价连接基团-单环或双环杂芳基_、单环 或双环杂芳基-二价连接基团-芳基_、芳基-二价连接基团-单环或双环杂芳基_，其中二 价连接基团的例子有一 〇 -、一 NH -、一 S -、一 S0 -、一 S02-、一 C0 -、一 C (一 NH) -、 -c ( = S) -、一 C ( = SO) -、一 C ( = S02) -、一 Ci 10亚烷基一、一C 3 10亚环烷基一、 一（3-10)元亚杂环烷基一等，芳基如苯基、萘基，单环杂芳基如5或6元含1-4个选自0、 N和S的杂芳基，双环杂芳基是由两个彼此独立的单环杂芳基，或一个苯基与一个单环杂芳 基稠合而成。
[0101] 根据本发明，连接基团是任选被取代的，取代基选自卤素如F-、Cl-、Br-和1-， NH2-、CN-，0H-，HS-，-N02, -CF3, -C00H，CH3C0-，（Ci 1Q烷基）-C00-，-o-c ! 1Q烷基，C ! 1Q烷基-、 C2 i。烯基-、C2 i。炔基-、单环或双环的C 3 i。环烷基-、芳基-、单环或双环杂芳基-;其中芳 基-如苯基、萘基；单环杂芳基如5或6元含1-4个选自0、N和S的杂芳基；双环杂芳基是