专利名称：一种固定化蛋白酶水解蛋白生产蛋白肽的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白酶酶解蛋白生产蛋白肽的方法，尤其涉及到应用固定化蛋白酶生产蛋白肽的方法。
背景技术：
蛋白肽是一种生物活性物质，是蛋白经蛋白酶水解或微生物发酵等方法所制得的具有某些生物学功能的混合低聚肽。从化学角度上讲，蛋白肽则是蛋白质中20个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称。生物学试验表明，机体摄入的蛋白质经消化道的酶作用后，大多是以低分子量肽形式吸收的，以游离氨基酸形式吸收的比例很小。进一步的试验又揭示了低分子量肽比游离氨基酸消化更快、吸收更多，上述研究结果都表明低分子量肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。而且，蛋白肽具有低抗原性，不会产生过敏反应，能促进发酵产生有益分泌物，能增强运动员体能和肌肉，促进肌红细胞复原和帮助恢复疲劳等。此外，蛋白肽具有多种机体代谢和生理调节功能，以消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、调节血脂等作用。它除了具有蛋白质的营养学特性外还具有小分子肽所特有的物化特性，即具有很好的溶解性、低黏度和抗凝胶形成性等。故此，蛋白肽是当前国际食品界最热门的研究课题。目前，已经研究证明了的蛋白肽有大豆以及豆粕蛋白生产的大豆肽，牛乳蛋白生产的酪蛋白磷酸肽、酪蛋白钙肽、降血压肽、类吗啡肽、免疫调节肽、抗诱变肽等，玉米蛋白生产的玉米肽，小麦、豌豆、鱼类等各种动植物蛋白生产的蛋白肽。
目前国内外在蛋白质水解方面主要采用了三种方法酸水解法、碱水解法和酶水解法。其中酸水解法和碱水解法属于化学水解，而酶水解法属于生物酶水解法。与前两种方法比较，酶水解法的反应条件温和、能量消耗较少，氨基酸不被破坏，也不产生消旋作用，而且效率较高，在营养成分的保留上也具有化学方法不可比拟的优点，因此酶水解法应用较广泛。
但是，应用游离蛋白酶直接加入到蛋白质溶液中水解蛋白，存在反应体系中的酶不能被回收造成生产成本高等缺陷，因而在工业上的应用受到了限制。为克服上述缺点，人们采用了酶固定化技术。固定化酶与游离酶相比，具有下列优点(1)酶的稳定性得到增强；(2)酶可再生利用；(3)便于工业连续化生产操作；(4)反应所需的空间小；(5)反应的最优化控制成为可能；(6)可得到高纯度、高产量的产品；(7)资源方便，减少污染。本研究通过将蛋白酶固定在无机载体上，并进一步制成可连续化生产的反应器的方式进行蛋白肽的生产，不仅有效地水解蛋白质，而且可使酶反复使用、产物与酶容易分离并降低了生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供了一种利用固定化蛋白酶水解蛋白生成蛋白肽的方法，可缩短酶解时间，酶解活性较高，得到的固定化酶可反复使用，并可连续化生产，提高酶的利用率，从而显著降低生产成本。
本发明目的是通过如下三个步骤实现的 1.介孔材料的制备 以Pluronic P123为模板剂，三甲苯(TMB)为扩孔剂，以正硅酸乙酯(TEOS)为有机硅源，以水为溶剂，用盐酸调节体系pH值，合成有序硅基介孔材料SBA-15。反应各物料按一定的摩尔配比进行反应。步骤为在磁力搅拌下，将硅源加入模板剂酸性水溶液中，室温下搅拌2h，然后于35℃下静止晶化24小时；在100℃下高压釜中反应24h后，过滤，用去离子水洗涤至中性，室温干燥后，在550℃焙烧4小时，得到SBA-15载体。该载体最可几孔径6.5nm，比表面积1007m2/g。
2.制备固定化蛋白酶 取适量的缓冲液，按一定次序加入适量的介孔材料，适量的蛋白酶以及适量的戊二醛溶液，在室温下，水浴中充分振荡吸附，进行蛋白酶固定化处理，经离心分离，并用缓冲液冲洗固定化酶三次后，得到固定化蛋白酶。
3.装柱 将10ml体积的湿的固定化蛋白酶用湿式填充法装入反应柱中，轻敲柱子使固定化酶填充紧密，确保床层没有气泡。
4.酪蛋白溶液经固定化蛋白酶酶解制备蛋白肽 将一定浓度的酪蛋白溶液(0.1-2mg/ml，优选0.4-0.8mg/ml)作为底物，以1000-2000ml/h流速通过反应柱，该蛋白液经固定化蛋白酶水解后得到蛋白肽。
其特征在于所述的蛋白溶液包括酪蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、小麦蛋白、花生蛋白等来源蛋白。
所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶等酶的一种或几种。
其中的固定化酶材料包括SBA-15，MCM-41，MCM-48，FCM等系列介孔材料。
具体实施例方式 本发明还将结合实施例进行进一步详述 实施例一 以Pluronic P123为模板剂，三甲苯(TMB)为扩孔剂，以正硅酸乙酯(TEOS)为有机硅源，以水为溶剂，用盐酸调节体系pH值，合成有序硅基介孔材料SBA-15。反应各物料摩尔配比为1TEOS∶0.017P123∶0.6TMB∶5.85HCl∶165H2O。在磁力搅拌下，将硅源加入模板剂酸性水溶液中，室温下搅拌2h，然后于35℃下静止晶化24小时；在100℃下高压釜中反应24h后，过滤，用去离子水洗涤至中性，室温干燥后，在550℃焙烧4小时，制得SBA-15载体。该载体最可几孔径9.8nm，比表面积977m2/g。
将5g按上述方法制得的介孔材料，加入到3mg/ml浓度的碱性蛋白酶中，在室温下震荡12h，加入交联剂戊二醛，使其最终浓度为0.75％，继续水浴中充分振荡12h，使碱性蛋白酶之间充分交联，经离心分离，并用缓冲液冲洗固定化酶三次后，得到固定化碱性蛋白酶。将10ml体积的湿的固定化蛋白酶用湿式填充法装入反应柱中，轻敲柱子使固定化酶填充紧密，确保床层没有气泡。得到用于制备蛋白肽的反应器。
实施例二 称取酪蛋白0.50g，精确至0.01g，用少量0.5mol/l氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的pH＝7.5的缓冲溶液约800ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后转入1000ml容量瓶中，用缓冲液稀释定容至刻度。
实施例三 将0.5mg/ml浓度的酪蛋白溶解于pH＝8.0的磷酸盐缓冲液中，在50℃下，以1000ml/h的速度流经按上述实施例一制得的反应器，收集流出液，浓缩，喷雾干燥的蛋白肽。将得到的蛋白肽与游离碱性蛋白酶水解得到的蛋白肽进行HPLC分析，结果见附图。
实施例四 按实施例二相似的方法配制的1mg/ml浓度的酪蛋白溶解于pH＝8.5的磷酸盐缓冲液中，在45℃下，以750ml/h的速度流经按上述实施例一制得的反应器，收集流出液，浓缩，喷雾干燥的蛋白肽。
实施例五 将2.0mg/ml浓度的酪蛋白溶解于pH＝7.5的醋酸盐缓冲液中，在45℃下以500ml/h的速度流经按上述实施例一制得的反应器，收集流出液，浓缩，喷雾干燥的蛋白肽。
本发明制得的蛋白肽可作为食品、保健品的添加剂使用，尤其可用于运动员饮用的饮料，也可作为饲料添加剂使用。
图1，为酪蛋白溶液经游离酶水解物的HPLC图；图2，为酪蛋白溶液经固定化酶反应器水解物的HPLC图。
权利要求
1、一种固定化蛋白酶水解蛋白质生产蛋白肽的方法，包括
(1)固定化无机载体的合成
以Pluronic P123为模板剂，三甲苯(TMB)为扩孔剂，以正硅酸乙酯(TEOS)为有机硅源，以水为溶剂，用盐酸调节体系pH值，合成有序硅基介孔材料SBA-15。通过煅烧的方法去除模板剂，得到孔径为6.5nm，比表面积1007m2/g的无机载体；
(2)蛋白酶的固定化
在pH适宜的缓冲液中，按一定次序加入适量的介孔材料，适量的蛋白酶以及适量的戊二醛溶液，在室温下，水浴中充分振荡吸附，对蛋白酶进行固定化处理，经离心分离，并用缓冲液冲洗固定化酶三次后，得到固定化蛋白酶；
(3)固定化酶反应器的制备
将制备得到固定化蛋白酶采用湿式填充法装入反应柱中，制得用于生产蛋白肽的固定化酶反应器；
(4)蛋白肽的生成
将一定浓度的酪蛋白溶液通过反应柱，该蛋白液经固定化蛋白酶水解后得到蛋白肽。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于蛋白质溶液的浓度为0.1-2mg/ml。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于蛋白质溶液的浓度优选为0.4-0.8mg/ml。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白溶液包括酪蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、小麦蛋白等动、植物来源的蛋白。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶等酶的一种或几种。
全文摘要
本发明是一种利用固定化酶连续水解蛋白质制备蛋白肽的方法。工艺步骤为合成用于蛋白酶固定化的无机载体；将蛋白酶固定于该无机载体上；制备可连续反应的酶水解反应器，再将蛋白质溶液进行酶水解。该方法工艺简单、可操作性强，而且反应条件温和，可重复利用固定化蛋白酶，经济成本低。
文档编号C12P21/00GK101294183SQ20071009838
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月24日 优先权日2007年4月24日
发明者董颖超, 涛 齐, 李军国, 俊 李, 王丽娜 申请人:中国农业科学院饲料研究所