专利名称：固定化蛋白酶及其在制备乳酪蛋白肽中的应用方法
技术领域：
本发明涉及一种固定化酶及其应用，尤其涉及一种固定化蛋白酶，本发明 还涉及该固定化蛋白酶在制备乳酪蛋白肽中的应用，属于食品生物技术领域。
背景技术：
功能性食品是二十一世纪食品工业发展的重点。开发各种具有生理活性的 功能营养因子，具有深远的生物学意义和重要的应用价值，也是当今国内外食 品界最热门的研究课题和极具发展前景的产业。
乳中含有大量不同活性的生物活性肽，这些肽或自然存在于乳中或源于乳 蛋白水解后的产物。由于其分子量较小，在小肠内以完整肽段的形式被人体吸 收，不会引起人体的免疫排斥反应，且具有多种特殊的生理活性功能。
乳酪蛋白经蛋白酶水解得到小分子乳酪蛋白肽，乳酪蛋白肽主要是由2 7 个氨基酸组成的多肽混合物，是一种多功能营养因子，具有免疫调节、抗血栓、 抗高血压、降胆固醇、抗菌等多种生理活性功能，可广泛应用于食品和医药等 行业，可制成天然降血压药、患者营养补剂、婴幼儿食品、老年食品、运动食 品和各种功能健康食品等。
乳源生物活性肽，因其源于天然食物蛋白以及多种特殊的生理活性功能， 已成为发达国家的研究热点。经过近20年的探索，到目前为止，已经发现了多 种乳源生物活性肽。国外对乳蛋白来源的ACE抑制肽研究有一定的报道，尤其 是曰本对来源于乳清蛋白、酪蛋白和酸奶中的ACE抑制肽进行了较多的研究， 取得了较大的进展。目前国内对此方面的研究才刚刚起步，国内数所高校进行 了乳源生物活性肽的研究，在蛋白酶的选择，酶解工艺等方面取得了一定的进 展。但目前只有极少数的生物活性肽能够进行规模化生产，如CPPs。对于大多 数乳蛋白来源的活性肽来说，其工业化生产还有一定的难度，主要是因为这些 生物活性肽在乳蛋白酶解液中的含量低，分离和提纯难度大，检测手段和技术不够成熟，这些都是阻碍乳蛋白源生物活性肽产业化的主要因素，也是今后研 究工作的重点所在。
目前国内已有蛋白酶水解乳酪蛋白制取乳酪蛋白肽的研究，但关于固定化 酶水解制备乳酪蛋白肽的研究尚未见报道。
发明内容
本发明目的之一是提供一种固定化蛋白酶。
本发明目的之二是将该固定化蛋白酶应用于制备乳酪蛋白肽。 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的 一种固定化蛋白酶，主要按照以下方法制备得到
(1) 将浓度为0.5 10%的壳聚糖酸性溶胶，搅拌，使溶胶液滴均匀分散， 滴入体积分数为2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度(按体积分数计) 达到0.2-3%，搅拌加入0.5-3 mol/L NaOH溶液，至NaOH溶液的终浓度(按体 积分数计)为0.05% 3%，于40-7(TC保温反应0.5-5 h，静置冷却后弃去上层， 依次用丙酮、无水乙醇抽洗，最后用蒸馏水冲洗，真空干燥，得到固定化载体 壳聚糖微球，备用；
(2) 向0.1% 5%的蛋白酶溶液中加入步骤(1)所制备的固定化载体壳 聚糖微球，其中，蛋白酶溶液与固定化载体壳聚糖微球按1-4 : 1的重量比进行 配比；置于摇瓶器中振荡吸附2-30 h，然后滴入体积分数为2.5%戊二醛溶液， 使戊二醛溶液的最终浓度(按体积分数计)达到0.2-3%，交联0.2-10 h，得到固定 化蛋白酶。
其中，所述的蛋白酶优选自木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋 白酶、动物蛋白水解酶、碱性蛋白酶或胃蛋白酶中的任意一种或一种以上按任 意比例所组成的复合酶。
根据需要，将本发明所制备得到的固定化蛋白酶装入或填充入合适的柱中 (作为参考，柱子材质可以为玻璃、工程塑料或不锈钢等材料，直径可以为 O50mm，长度可以为1200mm，装填系数可以为85-90%等；当然，本领域技术 技术人员可根据需要将上述参数作相应的修改)，得到固定化蛋白酶柱，可将 其应用于制备乳酪蛋白肽。作为一种优选的方法， 一种将上述固定化蛋白酶柱应用于制备乳酪蛋白肽 的方法，包括以下步骤(1)预处理乳酪蛋白溶液；(2)将经过预处理的乳酪 蛋白溶液过固定化蛋白酶柱，进行酶水解反应；(3)收集酶水解液，离心分离， 得上清液；(4)将上清液脱色处理后再进行脱盐处理；(5)将脱盐处理后的酶 解液进行纳滤处理；(6)浓縮；(7)浓縮后的产物包埋于壁材中；(8)喷雾干 燥，即得乳酪蛋白肽。 .
为了达到更好的技术效果，步骤(1)中所述的预处理优选为将乳酪蛋白
配制成浓度为1.0-6.0 mg/mL的溶液在60-10(TC温度条件下预热处理5-20 min; 然后将乳酪蛋白溶液冷却至30-60°C;
优选的，步骤(2)中经过预处理的浓度为1.0-6.0 mg/mL的乳酪蛋白溶液 以0.1-5.0 mL/min的流速过固定化蛋白酶柱；所述的酶水解反应条件优选为温 度30-65。C， pH为4.0-9.0。
步骤(3)中所述的离心分离优选在以下条件下进行采用离心机于 4000—5000r/min，离心分离15--20min，分离未完全酶解的乳酪蛋白沉淀物，得 到澄清透明的酶解液。
步骤(4)中所述的脱色处理优选在以下条件下进行采用氢氧化钠溶液将 离心上清液pH调整至6.0-7.0，加入溶液量0.5-3.0%的粉末或颗粒活性炭，于 30-50'C条件下进行脱色处理，1.0-3.0 h后过滤分离。
步骤(4)中所述的脱盐处理优选在以下条件下进行经脱色处理的乳酪蛋 白酶解液，采用浸泡法或过柱法，先经24g/100mL的强酸性苯乙烯系阳离子交 换树脂，处理30min，后经24 g/100mL的强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂处理 30min，进行脱盐处理。
步骤(5)中所述的纳滤分离优选在以下条件下进行采用NF-1即截留分 子量为2000的纳滤膜，操作压力0.3-1.0Mpa，截留分离分子量范围小于2000 的乳酪蛋白肽。
步骤(6)中所述的浓縮优选按照以下条件进行控制真空度为600-750 mmHg，在蒸发温度60-7(TC条件下，将乳酪蛋白肽溶液浓縮至固形物含量为 10-30%;通过真空蒸发浓縮，得到高含量的乳酪蛋白肽溶液；
步骤(7)中所述的壁材由多孔淀粉与p-环糊精复合而成。本发明中所用到的各种原料都可通过商业途径购买得到，例如所用到的乳 酪蛋白、壳聚糖、胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、动物蛋白水解酶、酸性 蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等都可从生物试剂公司购买得 到。
固定化酶是采用吸附交联法、偶联法等，把酶固定于特定载体上的技术， 它能提高酶分子结构的稳定性，延长酶的使用期和保管期，将反应物和产物分 开，有效控制生产过程，省去热处理使酶失活的步骤，简化生产工艺，更重要 的是它能在生产中反复连续使用，大幅度提高酶的利用率。
本发明首先制备得到固定化的蛋白酶，再用固定化的蛋白酶对乳酪蛋白进 行酶解，在此基础上，筛选和优化了酶解、离心分离、脱色脱盐、纳滤分离、 浓縮、复合微胶囊包埋、喷雾干燥等最佳工艺条件，建立了一整套采用固定化 蛋白酶水解制备乳酪蛋白肽的方法。
本发明制备乳酪蛋白肽方法采用固定化酶水解乳酪蛋白，固定化酶可反复 多次使用，使用效率高，有效降低了生产成本，产品分离方便、成本较低、生 产条件温和、水解程度容易控制；所制备的乳酪蛋白肽产品具有肽含量高、肽 分子量分布范围优、质量好、无苦味、安全性高等优点，为乳酪蛋白的深度开 发利用奠定基础。经检测，本发明方法所制备的乳酪蛋白肽含量(以干基计) 高达75.05%;肽分子量分布范围为小于2409道尔顿的达到97.79%。
本发明方法所制备得到的乳酪蛋白肽主要是由2 7个氨基酸组成的多肽混 合物，是一种多功能营养型因子，具有免疫调节、抗血栓、抗高血压、降胆固 醇、抗菌等多种生理活性功能，可广泛应用于食品和医药等行业，可制成天然 降血压药、患者营养补剂、婴幼儿食品、老年食品、运动食品和各种功能健康 食品等。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着 描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何 限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对 本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
一、 试验材料
乳酪蛋白(青海凯兴干酪素有限公司)；壳聚糖(广州凯利生物制剂制品 厂)；戊二醛(体积分数50%， Fluka公司，上海化学试剂公司分装)；胃蛋白 酶120万u/g、胰蛋白酶250万u/g (国药集团化学试剂有限公司)；菠萝蛋白 酶85万u/g、动物蛋白水解酶10万u/g (广西南宁庞博生物科技有限公司)； 酸性蛋白酶5万u/g (无锡市酶制剂厂)，碱性蛋白酶200万u/g、中性蛋白酶 200万u/g、木瓜蛋白酶7万u/g (上海宝丰生化有限公司)。
二、 肽分子量分布测定方法 A.l方法提要
采用高效凝胶过滤色谱法测定。即以多孔性填料为固定相，依据样品组分 分子体积大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220纳米条件下检测， 使用凝胶色谱测定分布的专用数据处理软件(即GPC软件)，对色谱图及其数 据进行处理，计算得到多肽的相对分子量大小及分布范围。 A.2仪器
(1) 高效液相色谱仪，配有紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱 工作站或积分仪；
(2) 流动相真空抽滤脱气装置；
(3) 超声波震荡器；
(4) 分析天平，感量0.0001g。 A.3试剂
(1) 乙晴，色谱纯；
(2) 三氟醋酸，分析纯；
(3) 水，超纯级或二次蒸馏水；
(4) 分子量校正曲线所用标准品
(a) 细胞色素C (cyyochrome， MW 12500)
(b) 抑肽酶(aprotinin,MW6500)MW 1450)(d) 乙氨酸一乙氨酸一清氨酸一精氨酸(MW451)(e) 乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸(MW 189) A.4色谱条件与系统适应性实验色谱柱TSKgel G2000 SWXL 300 mmx7.8mm，或性能与此相近的同类型 其它适用于测定蛋白质和肽的凝胶柱。流动相乙晴水三氟乙酸，10: 90: O.l(体积比) 检测波长UV220nm 流速0.5ml/min 柱温30°C 进样体积l(VL为使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱条件下，凝胶色谱柱的柱效即理论塔板数(AO按三肽标准品(乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸)峰计算不低于 10000，肽的分配系数(&)应在0 1之间。 A.5分子量校正曲线制作分别用流动相配制成质量分数为0.1%的上述不同分子量肽标准品溶液，用 孔径0.2—0.5pm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后分别进样，得到系列标准品的 色谱图。以分子量的对数(lgMF)对保留时间作图或作线性回归，得到分子量 校正曲线及其方程。 A.6 样品制备称取样品约20.0mg于10ml容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声震荡10 min，使样品充分溶解混匀，用孔径为0.2,—0.5iam聚四氟乙烯或尼龙过滤膜 过滤后，上机进样。 A.7分子量分布的计算将A.5制备的样品溶液在上述色谱条件下分析。然后用GPC数据处理软件， 将样品的色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，即可得到样品的肽分子量及 其分布范围。用峰面积归一法可计得不同分子量范围肽的相对百分比。表l 乳酪蛋白肽分子量分布分子量范围峰面积百分比 (%，入220nm)数均分子量重均分子量〉3000 3000 2000 2000 1000 1000~500 500 130 〈1300. 72 1.49 5.45 20. 55 61.27 10. 52395324091458634257403024491505658285三、乳酪蛋白水解度测定方法3. 1溶液中可溶性氮的测定方法(微量扩散法)取乳酪蛋白酶解澄清液5 ml，加入1 g消化催化剂和10 ml浓硫酸，在高温 下消化至黄绿色后，取出冷却至室温，加水定容。然后取5 ml加入到扩散皿的 外室，并在扩散皿的内室加入2ml的硼酸溶液，向外室中加入4ml浓NaOH溶 液，并迅速盖上盖片。在自然条件放置24h左右后，用标准的盐酸溶液滴定硼 酸溶液至紫罗兰色即可。含氮量N (%) = (V2-V。 xNHx0.014x稀释倍数/样品重量xl00。/。 注V1:空白所需盐溶液体积(ml)V2:滴定待测液耗用标准酸体积(ml) NH: 标准酸当量浓度 0.014 1ml当量氮的克数 3. 2水解度的测定方法——TCA法取10 ml酶解物中加入10 mlTCA，在水浴中加热20 min，然后在4000 r/min 转速下离心15min。取上清液，蛋白质总氮和上清液可溶性氮由3.1中方法测得。水解度(DH)注Ni空白试样的含氮量N2乳酪蛋白未经酶解的含氮量N3乳酪蛋白经酶解后的含氮量。实施例l固定化胰蛋白酶的制备(1) 将10%的壳聚糖酸性溶胶，搅拌，使溶胶液滴均匀分散，滴入体积分数为2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度(体积分数)达到3%,搅拌 加入3 mol/LNaOH溶液，至NaOH的终浓度(体积分数)为3%，于7(TC保温 反应0.5，静置冷却后弃去上层，依次用丙酮、无水乙醇抽洗，最后用蒸馏水冲 洗，真空干燥，得到固定化载体壳聚糖微球，备用；(2) 向5%的胰蛋白酶溶液中加入固定化载体壳聚糖微球，其中胰蛋白酶溶液固定化载体壳聚糖微球=4: 1;置于摇瓶器中振荡吸附30 h，然后滴入体积分数为2.5%戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度(体积分数)达到3%，交 联0.2-10 h，即得固定化胰蛋白酶。实施例2固定化胃蛋白酶的制备(1) 将0.5%的壳聚糖酸性溶胶，搅拌，使溶胶液滴均匀分散，滴入体积 分数为2.5%的戊二醛溶液，使戊二酸溶液的最终浓度(体积分数)达到0.2%， 搅拌加入0.5 mol/L NaOH溶液，至NaOH的终浓度(体积分数)为0.05%,于 40'C保温反应5h，静置冷却后弃去上层，依次用丙酮、无水乙醇抽洗，最后用 蒸馏水冲洗，真空干燥，得到固定化载体壳聚糖微球，备用；(2) 向0.1%的胃蛋白酶溶液中加入所制备的固定化载体壳聚糖微球，其 中胃蛋白酶溶液固定化载体壳聚糖微球=1: 1;置于摇瓶器中振荡吸附2 h， 然后滴入体积分数为2.5%戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度(体积分数)达 到0.2%，交联0.2-10 h，即得固定化胃蛋白酶。实施例3固定化菠萝蛋白酶的制备(1) 将5%的壳聚糖酸性溶胶，搅拌，使溶胶液滴均匀分散，滴入体积分 数为2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度(体积分数)达到0.5%，搅 拌加入0.8mol/LNaOH溶液，至NaOH的终浓度(体积分数)为0.08%，于50°C 保温反应2.5h，静置冷却后弃去上层，依次用丙酮、无水乙醇抽洗，最后用蒸 馏水冲洗，真空干燥，得到固定化载体壳聚糖微球，备用；(2) 向1.5%的菠萝蛋白酶溶液中加入占菠萝蛋白酶溶液体积5%的所制备 的固定化载体壳聚糖微球，其中菠萝蛋白酶溶液固定化载体壳聚糖微球=3.5:1;置于摇瓶器中振荡吸附10h，然后滴入体积分数为2.5°/。戊二醛溶液，使戊二 醛溶液的最终浓度(体积分数)达到0.8%,交联0.2-10h，即得固定化菠萝蛋白 酶。实施例4固定化木瓜蛋白酶的制备(1) 将0.6%的壳聚糖酸性溶胶，搅拌，使溶胶液滴均匀分散，滴入体积分 数为2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度(体积分数)达到0.3%,搅 拌加入0.6 mol/L NaOH溶液，至NaOH的终浓度(体积分数)为0.07%，于45°C 保温反应5h，静置冷却后弃去上层，依次用丙酮、无水乙醇抽洗，最后用蒸馏 水冲洗，真空干燥，得到固定化载体壳聚糖微球，备用；(2) 向0.2%的木瓜蛋白酶溶液中加入占木瓜蛋白酶溶液体积4%的所制备 的固定化载体壳聚糖微球，其中木瓜蛋白酶溶液固定化载体壳聚糖微球=1.2: 1;置于摇瓶器中振荡吸附30h，然后滴入体积分数为2.5%戊二醛溶液，使戊二 酸溶液的最终浓度(体积分数)达到1.5%，交联0.2-10 h，即得固定化木瓜蛋白 酶。实施例5固定化中性蛋白酶的制备(1) 将9%的壳聚糖酸性溶胶，搅拌，使溶胶液滴均匀分散，滴入体积分 数为2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度(体积分数)达到2.5%，搅 拌加入2.5 mol/L NaOH溶液，至NaOH的终浓度(体积分数)为1.5%，于60°C 保温反应1.5h，静置冷却后弃去上层，依次用丙酮、无水乙醇抽洗，最后用蒸 馏水冲洗，真空干燥，得到固定化载体壳聚糖微球，备用；(2) 向4.5%的中性蛋白酶溶液中加入占中性蛋白酶溶液体积9%的所制备的固定化载体壳聚糖微球，其中中性蛋白酶溶液固定化载体壳聚糖微球=1: 1; 置于摇瓶器中振荡吸附20h，然后滴入体积分数为2.5%戊二醛溶液，使戊二醛 溶液的最终浓度(体积分数)达到2.0。/。，交联0.2-10h，即得固定化中性蛋白酶。实施例6固定化碱性蛋白酶的制备(1)将5.5%的壳聚糖酸性溶胶，搅拌，使溶胶液滴均匀分散，滴入体积分数为2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度(体积分数)达到1.2%，搅 拌加入1.5mol/LNaOH溶液，至NaOH的终浓度(体积分数)为0.5%，于65°C 保温反应5h，静置冷却后弃去上层，依次用丙酮、无水乙醇抽洗，最后用蒸馏 水冲洗，真空干燥，得到固定化载体壳聚糖微球，备用；(2)向0.2%的碱性蛋白酶溶液中加入占碱性蛋白酶溶液体积6%的所制备 的固定化载体壳聚糖微球，其中碱性蛋白酶溶液固定化载体壳聚糖微球-3: 1; 置于摇瓶器中振荡吸附10h，然后滴入体积分数为2.5%戊二醛溶液，使戊二醛 溶液的最终浓度(体积分数)达到1.2 %，交联0.2-10 h，即得固定化碱性蛋白酶。实施例7固定化动物蛋白水解酶的制备(1) 将9.5%的壳聚糖酸性溶胶，搅拌，使溶胶液滴均匀分散，滴入体积 分数为2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度(体积分数)达到2.8%， 搅拌加入2.5mol/LNaOH溶液，至NaOH的终浓度(体积分数)为1.5%，于45°C 保温反应5h，静置冷却后弃去上层，依次用丙酮、无水乙醇抽洗，最后用蒸馏 水冲洗，真空干燥，得到固定化载体壳聚糖微球，备用；(2) 向4. 5%的动物蛋白水解酶溶液中加入所制备的固定化载体壳聚糖微 球，其中动物蛋白水解酶溶液固定化载体壳聚糖微球=2: 1;置于摇瓶器中振 荡吸附6h，然后滴入体积分数为2.5%戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度(体 积分数)达到2.5%，交联0.2-10 h，即得固定化动物蛋白水解酶。实施例8固定化胰蛋白酶柱的制备将实施例1戶斥制备的固定化胰蛋白酶填充于柱 中，柱子自制，柱子材质为玻璃、工程塑料或不锈钢等材料，直径0)50mm，长 度1200mm，装填系数为85%，得到固定化胰蛋白酶柱；将乳酪蛋白配制成浓度为6.0mg/mL的溶液在IO(TC温度条件下预热处理5 min;然后将乳酪蛋白溶液冷却至6(TC;将经过预处理的浓度为6.0mg/mL的乳 酪蛋白溶液以5.0 mL/min的流速过固定化胰蛋白酶柱进行酶水解反应；所述的 酶水解反应条件为温度65。C， pH为9.0;收集过柱的酶解液，经检测，乳酪 蛋白的水解度为44.3%;采用离心机于5000 rpm，离心分离15 min，得到澄清透明的上清液；将该上清液pH调整至7.0，加入为离心上清液重量的2.0%的粉 末活性炭，于5(TC条件下进行脱色处理，3.0h后过滤分离；经脱色处理的乳酪 蛋白酶解液采用过柱法，先经24 g/100mL的强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂， 处理乳酪蛋白肽30min后，后经24 g/100mL的强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂 处理乳酪蛋白肽30min，进行脱盐处理；采用NF-1即截留分子量为2000的纳滤 膜，在操作压力0,3-1.0Mpa的条件，截留分离分子量范围小于2000的乳酪蛋白 肽；控制真空度为600-750 mmHg，在蒸发温度60-7(TC条件下，将乳酪蛋白肽 溶液浓縮至固形物含量为10-30%;采用多孔淀粉与P-环糊精复合壁材，与乳酪 蛋白肽混合，搅拌均匀后，再置于高压均质机中，30MPa压力均质，将乳酪蛋 白肽均匀地分散于壁材中，进行复合微胶囊包埋稳定化；喷雾干燥，控制进风 温度190°C、出风温度95。C、进料流量40ml/min，将均质后的乳化液，经喷雾 干燥，得到粉末状乳酪蛋白肽。经检测，本实施例所制备的乳酪蛋白肽含量(以干基计)为75.05%;肽分 子量分布范围为小于2409道尔顿的达到97.79%实施例9固定化胃蛋白酶柱的制备将实施例2所制备的固定化胃蛋白酶填充于柱 中，柱子自制，柱子材质为玻璃、工程塑料或不锈钢等材料，直径0)50mm，长 度1200mm，装填系数为85%，得到固定化胃蛋白酶柱；将乳酪蛋白配制成浓度为1.0mg/mL的溶液在6(TC温度条件下预热处理20 min;然后将乳酪蛋白溶液冷却至3(TC;将经过预处理的浓度为lmg/mL的乳酪 蛋白溶液以0.1mL/min的流速过固定化胃蛋白酶柱进行酶水解反应；所述的酶 水解反应条件为温度3(TC， pH为4.0;收集过柱的酶水解液，经检测，乳清 蛋白的水解度为42.2%;将过柱的酶水解液采用离心机于4000 rpm，离心分离 20 min，得到澄清透明的上清液；将该上清液pH调整至6.0，加入为离心上清 液重量的1.0%的粉末活性炭，于4(TC条件下进行脱色处理，1.5h后过滤分离； 经脱色处理的乳酪蛋白酶解液采用过柱法，先经24 g/100mL的强酸性苯乙烯系 阳离子交换树脂，处理乳酪蛋白肽30min后，后经24g/100mL的强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂处理乳酪蛋白肽30min，进行脱盐处理；采用NF-1即截留分子 量为2000的纳滤膜，在操作压力0.3—l.OMpa的条件，截留分离分子量范围小 于2000的乳酪蛋白肽；控制真空度为600-750 mmHg，在蒸发温度60-7(TC条件 下，将乳酪蛋白肽溶液浓縮至固形物含量为10-30%;采用多孔淀粉与P-环糊精 复合壁材，与乳酪蛋白肽混合，搅拌均匀后，再置于高压均质机中，30MPa压 力均质，将乳酪蛋白肽均匀地分散于壁材中，进行复合微胶囊包埋稳定化；喷 雾干燥，控制进风温度190°C、出风温度95。C、进料流量40ml/min，将均质后 的乳化液，经喷雾干燥，得到粉末状乳酪蛋白肽。经检测，本实施例所制备的乳酪蛋白肽含量(以干基计)达73.97%;肽 分子量分布范围为小于2409道尔顿的97.58占％。实施例10固定化菠萝蛋白酶柱的制备将实施例3所制备的固定化菠萝蛋白酶填充 于柱中，柱子自制，柱子材质为玻璃、工程塑料或不锈钢等材料，直径。50mm， 长度1200mm，装填系数为85%，得到固定化菠萝蛋白酶柱；将乳酪蛋白配制成浓度为4mg/mL的溶液在80。C温度条件下预热处理10 min;然后将乳酪蛋白溶液冷却至4(TC;将经过预处理的浓度为4mg/mL的乳酪 蛋白溶液以2.0mL/min的流速过固定化菠萝蛋白酶柱进行酶水解反应；所述的 酶水解反应条件为温度45'C, pH为7.0;收集过柱的酶水解液，经检测，乳 清蛋白的水解度为41.9%;将过柱的酶解液采用离心机于4500 rpm，离心分离 20 min，得到澄清透明的上清液；将该上清液pH调整至6.5，加入为离心上清 液重量的1.5%的粉末活性炭，于45'C条件下进行脱色处理，2.5h后过滤分离； 经脱色处理的乳酪蛋白酶解液釆用过柱法，先经24 g/100mL的强酸性苯乙烯系 阳离子交换树脂，处理乳酪蛋白肽30min后，后经24g/100mL的强碱性苯乙烯 系阴离子交换树脂处理乳酪蛋白肽30min，进行脱盐处理；采用NF-1即截留分子 量为2000的纳滤膜，在操作压力0.3—l.OMpa的条件，截留分离分子量范围小 于2000的乳酪蛋白肽；控制真空度为600-750 mmHg,在蒸发温度60-70。C条件 下，将乳酪蛋白肽溶液浓缩至固形物含量为10-30%;采用多孔淀粉与p-环糊精 复合壁材，与乳酪蛋白肽混合，搅拌均匀后，再置于高压均质机中，30MPa压力均质，将乳酪蛋白肽均匀地分散于壁材中，进行复合微胶囊包埋稳定化；喷雾干燥，控制进风温度190°C、出风温度95'C、进料流量40ml/min，将均质后 的乳化液，经喷雾干燥，得到粉末状乳酪蛋白肽。经检测，本实施例所制备的乳酪蛋白肽含量(以干基计)达73.29%;肽分 子量分布范围为小于2409道尔顿的占97.24%。实施例11固定化木瓜蛋白酶柱的制备将实施例4所制备的固定化木瓜蛋白酶填充 于柱中，柱子自制，柱子材质为玻璃、工程塑料或不锈钢等材料，直径0)50mm， 长度1200mm，装填系数为85%，得到固定化木瓜蛋白酶柱；将乳酪蛋白配制成浓度为3.0mg/mL的溶液在7(TC温度条件下预热处理8 min;然后将乳酪蛋白溶液冷却至35°〇；将经过预处理的浓度为5mg/mL的乳酪 蛋白溶液以1.5 mL/min的流速过固定化木瓜蛋白酶柱；所述的酶水解反应条件 为温度55'C， pH为8.0;收集过柱的酶解液，经检测，乳清蛋白的水解度为 42.1%;将所收集过柱的酶解液，采用离心机于4000rpm，离心分离20 min，得 到澄清透明的上清液；将该上清液pH调整至7.0，加入为离心上清液重量的2.0 %的粉末活性炭，于5(TC条件下进行脱色处理，3h后过滤分离；经脱色处理 的乳酪蛋白酶解液采用过柱法，先经24 g/100mL的强酸性苯乙烯系阳离子交换 树脂，处理乳酪蛋白肽30min后，后经24g/100mL的强碱性苯乙烯系阴离子交 换树脂处理乳酪蛋白肽30min，进行脱盐处理；采用NF-1即截留分子量为2000 的纳滤膜，在操作压力0.3-1.0Mpa的条件，截留分离分子量范围小于2000的乳 酪蛋白肽；控制真空度为600-750 mmHg，在蒸发温度60-70'C条件下，将乳酪 蛋白肽溶液浓縮至固形物含量为10-30%;采用多孔淀粉与P-环糊精复合壁材， 与乳酪蛋白肽混合，搅拌均匀后，再置于高压均质机中，30MPa压力均质，将 乳酪蛋白肽均匀地分散于壁材中，进行复合微胶囊包埋稳定化；喷雾干燥，控 制进风温度190°C、出风温度95。C、进料流量40ml/min，将均质后的乳化液， 经喷雾干燥，得到粉末状乳酪蛋白肽。经检测，本实施例所制备的乳酪蛋白肽含量(以干基计)达72.8%;肽分 子量分布范围为小于2409道尔顿的占96.89%。16固定化中性蛋白酶柱的制备将实施例5所制备的固定化中性蛋白酶填充于柱中，柱子自制，柱子材质为玻璃、工程塑料或不锈钢等材料，直径O50mm， 长度1200mm，装填系数为85%，得到固定化中性蛋白酶柱；将乳酪蛋白配制成浓度为2.0mg/mL的溶液在95'C温度条件下预热处理5 min;然后将乳酪蛋白溶液冷却至5(TC;将经过预处理的浓度为2mg/mL的乳酪 蛋白溶液以4.5 mL/min的流速过固定化中性蛋白酶柱进行酶水解反应；所述的 酶水解反应条件为温度35X:， pH为5.0;收集过柱的酶解液，经检测，乳清 蛋白的水解度为41.9%;将酶解液采用离心机于4500 rpm，离心分离20 min， 得到澄清透明的上清液；将该上清液pH调整至7.0，加入为离心上清液重量的 1.5%的粉末活性炭，于45i:条件下进行脱色处理，2.5h后过滤分离；经脱色处 理的乳酪蛋白酶解液采用过柱法，先经24 g/100mL的强酸性苯乙烯系阳离子交 换树脂，处理乳酪蛋白肽30min后，后经24g/100mL的强碱性苯乙烯系阴离子 交换树脂处理乳酪蛋白肽30min，进行脱盐处理;采用NF-1即截留分子量为2000 的纳滤膜，在操作压力0.3-1.0Mpa的条件，截留分离分子量范围小于2000的乳 酪蛋白肽；控制真空度为600-750 mmHg，在蒸发温度60-7(TC条件下，将乳酪 蛋白肽溶液浓缩至固形物含量为10-30%;采用多孔淀粉与P-环糊精复合壁材， 与乳酪蛋白肽混合，搅拌均匀后，再置于高压均质机中，30MPa压力均质，将 乳酪蛋白肽均匀地分散于壁材中，进行复合微胶囊包埋稳定化；喷雾干燥，控 制进风温度190'C、出风温度95。C、进料流量40ml/min，将均质后的乳化液， 经喷雾干燥，得到粉末状乳酪蛋白肽。经检测，本实施例所制备的乳酪蛋白肽含量(以干基计)达71.58%;肽分 子量分布范围为小于2409道尔顿的占95.27%。实施例13固定化碱性蛋白酶柱的制备将实施例6所制备的固定化碱性蛋白酶填充 于柱中，柱子自制，柱子材质为玻璃、工程塑料或不锈钢等材料，直径O50mm， 长度1200mm，装填系数为85%，得到固定化碱性蛋白酶柱；将乳酪蛋白配制成浓度为4.0mg/mL的溶液在65。C温度条件下预热处理20min;然后将乳酪蛋白溶液冷却至3(TC;将经过预处理的浓度为4mg/mL的乳酪 蛋白溶液以0.2 mL/min的流速过固定化碱性蛋白酶柱进行酶水解反应；所述的 酶水解反应条件为温度45"C， pH为7.0;收集过柱的酶解液，经检测，乳清 蛋白的水解度为40.9%;将所收集过柱的酶解液采用离心机于4000rpm，离心分 离20min，得到澄清透明的上清液；将该上清液pH调整至7.0，加入为离心上 清液重量的2.0%的粉末活性炭，于5(TC条件下进行脱色处理，1.5h后过滤分离； 经脱色处理的乳酪蛋白酶解液采用过柱法，先经24 g/100mL的强酸性苯乙烯系 阳离子交换树脂，处理乳酪蛋白肽30min后，后经24g/100mL的强碱性苯乙烯 系阴离子交换树脂处理乳酪蛋白肽30min,进行脱盐处理；采用NF-1即截留分子 量为2000的纳滤膜，在操作压力0.3-l.OMpa的条件，截留分离分子量范围小 于2000的乳酪蛋白肽；控制真空度为600-750 mmHg，在蒸发温度60-70'C条件 下，将乳酪蛋白肽溶液浓縮至固形物含量为10-30%;采用多孔淀粉与(3-环糊精 复合壁材，与乳酪蛋白肽混合，搅拌均匀后，再置于高压均质机中，30MPa压 力均质，将乳酪蛋白肽均匀地分散于壁材中，进行复合微胶囊包埋稳定化；喷 雾干燥，控制进风温度190°C、出风温度95t:、进料流量40ml/min，将均质后 的乳化液，经喷雾干燥，得到粉末状乳酪蛋白肽。经检测，本实施例所制备的乳酪蛋白肽含量(以干基计)达72.68%;肽分 子量分布范围为小于2409道尔顿的占95.87%。实施例14固定化动物蛋白水解酶柱的制备将实施例7所制备的固定化动物蛋白水 解酶填充于柱中，柱子自制，柱子材质为玻璃、工程塑料或不锈钢等材料，直 径①50mm，长度1200mm，装填系数为85%，得到固定化动物蛋白水解酶柱；将乳酪蛋白配制成浓度为6.0mg/mL的溶液在10(TC温度条件下预热处理20 min;然后将乳酪蛋白溶液冷却至60'C;将经过预处理的浓度为6.0mg/mL的乳 酪蛋白溶液以5.0 mL/min的流速过固定化动物蛋白水解酶柱进行酶水解反应； 所述的酶水解反应条件优选为温度65。C， pH为4.0;收集过柱的酶解液，经 检测，乳清蛋白的水解度为41.6%;将收集过柱的酶解液采用离心机于5000rpm， 离心分离15min，得到澄清透明的上清液；将该上清液pH调整至7.0，加入为离心上清液重量的2.0%的粉末活性炭，于5(TC条件下进行脱色处理，3.0h后 过滤分离；经脱色处理的乳酪蛋白酶解液采用过柱法，先经24g/100mL的强酸 性苯乙烯系阳离子交换树脂，处理乳酪蛋白肽30min后，后经24g/100mL的强 碱性苯乙烯系阴离子交换树脂处理乳酪蛋白肽30min，进行脱盐处理；采用NF-1 即截留分子量为2000的纳滤膜，在操作压力0.3-1.0Mpa的条件，截留分离分子 量范围小于2000的乳酪蛋白肽；控制真空度为600-750 mmHg，在蒸发温度 60-7(TC条件下，将乳酪蛋白肽溶液浓縮至固形物含量为10-30%;采用多孔淀粉 与P-环糊精复合壁材，与乳酪蛋白肽混合，搅拌均匀后，再置于高压均质机中， 30MPa压力均质，将乳酪蛋白肽均匀地分散于壁材中，进行复合微胶囊包埋稳 定化；喷雾干燥，控制进风温度190°C、出风温度95'C、进料流量40ml/min， 将均质后的乳化液，经喷雾干燥，得到粉末状乳酪蛋白肽。经检测，本实施例所制备的乳酪蛋白肽含量(以干基计)达72.75%;肽分 子量分布范围为小于2409道尔顿的占95.12%。
权利要求
1. 一种固定化蛋白酶，其特征在于，主要按照以下方法制备得到(1)将0.5～10％的壳聚糖酸性溶胶，搅拌，使溶胶液滴均匀分散，滴入体积分数为2.5％的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度按体积分数计为0.2-3.0％，搅拌加入0.5-3.0mol/L NaOH溶液，至NaOH溶液的终浓度按体积分数计为0.05％～3.0％，于40-70℃保温反应0.5-5.0小时，静置冷却后弃去上层，依次用丙酮、无水乙醇抽洗，最后用蒸馏水冲洗，真空干燥，得到固定化载体壳聚糖微球，备用；(2)向浓度为0.1％～5.0％的蛋白酶溶液中加入固定化载体壳聚糖微球，其中，蛋白酶溶液与固定化载体壳聚糖微球按1-4∶1的重量比进行配比；振荡吸附2-30小时，然后滴入体积分数为2.5％戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度按体积分数计为0.2-3.0％，交联0.2-10.0小时，即得。
2、 按照权利要求1所述的固定化蛋白酶，其特征在于所述的蛋白酶选自 木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、动物蛋白水解酶、碱性蛋 白酶或胃蛋白酶中的任意一种或一种以上按任意比例所组成的复合酶。
3、 由权利要求1或2所述的固定化蛋白酶制备得到的固定化蛋白酶柱。
4、 权利要求3所述的固定化蛋白酶柱在制备乳清蛋白肽中的应用，包括 (1)预处理乳酪蛋白溶液；(2)将经过预处理的乳酪蛋白溶液流过所述的固定化蛋白酶柱，进行酶水解反应；(3)收集酶水解液，离心分离，得上清液；(4) 将上清液脱色处理后再进行脱盐处理；(5)将脱盐处理后的酶解液进行纳滤处 理；(6)浓縮；(7)浓縮后的产物包埋于壁材中；(8)喷雾干燥。
5、 按照权利要求4的应用，其特征在于步骤(1)中所述的预处理为 将乳酪蛋白配制成浓度为1.0-6.0 mg/mL的溶液在60-100'C温度条件下预热处理 5-20分钟，然后将乳酪蛋白溶液冷却至30-6(TC。
6、 按照权利要求4的应用，其特征在于步骤(2)中经过预处理的浓度 为1.0-6.0 mg/mL的乳酪蛋白溶液以0.1-5.0 mL/min的流速过固定化蛋白酶柱； 所述的酶水解反应条件为温度30-65X:， pH为4.0-9.0。
7、 按照权利要求4的应用，其特征在于步骤(4)中所述的脱色处理在 以下条件下进行将离心上清液pH调整至6.0-7.0，加入上清液重量0.5-3.0%的活性炭粉末或颗粒，于30-5(TC条件下进行脱色处理，1.0-3.0小时后过滤分离。
8、 按照权利要求4的应用，其特征在于步骤(4)中所述的脱盐处理在 以下条件下进行经脱色处理的乳酪蛋白酶解液采用浸泡法或过柱法，先经24 g/100mL的强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，处理30分钟后，后经24g/100mL 的强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂处理30分钟，进行脱盐处理。
9、 按照权利要求4的应用，其特征在于步骤(5)中所述的纳滤处理在 以下条件下进行采用NF-1即截留分子量为2000的纳滤膜，操作压力 0.3-1.0Mpa，截留分离分子量范围小于2000的乳酪蛋白肽。
10、 按照权利要求4的应用，其特征在于步骤(6)中所述的浓縮按照以 下条件进行控制真空度为600-750 mmHg，在蒸发温度60-70"C条件下，将乳 酪蛋白肽溶液浓縮至固形物含量为10-30%;通过真空蒸发浓縮，得到高含量的 乳酪蛋白肽溶液；步骤(7)中所述的壁材由多孔淀粉与(3-环糊精复合而成。
全文摘要
本发明公开了一种固定化蛋白酶及其在制备乳酪蛋白肽中的应用方法。本发明固定化蛋白酶主要制备方法如下(1)制备固定化载体壳聚糖微球；(2)向蛋白酶溶液中加入壳聚糖微球，振荡吸附，滴入戊二醛溶液，交联，即得。本发明制备乳酪蛋白肽的方法采用固定化酶水解乳酪蛋白。固定化酶可反复多次使用，使用效率高，有效的降低了生产成本，产品分离方便、成本较低、生产条件温和、水解程度容易控制；所制备的乳酪蛋白肽产品具有肽含量高、肽分子量分布范围优、质量好、无苦味、安全性高等优点。经检测，本发明方法所制备的乳酪蛋白肽含量(以干基计)高达75.05％；肽分子量分布范围为小于2409道尔顿的达到97.79％。
文档编号C12N11/00GK101260397SQ200810094030
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月28日 优先权日2008年4月28日
发明者周利根, 王君虹, 郜海燕, 陈新峰 申请人:浙江省农业科学院