专利名称：黄精凝集素Ⅱ蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物凝集素及其应用，特别涉及一种以百合科植物囊丝黄精(Polygonatumcyrtonema Hua.)这种中草药为原料制备的黄精凝集素II蛋白及其应用。
背景技术：
凝集素(Lectin)是自然界中广泛存在的一类非酶、非免疫来源的、具有糖结合专一性并能使糖复合物沉淀的蛋白或糖蛋白。从第一个植物凝集素在蓖麻籽中发现到目前为止，人们已发现并分离了几百种凝集素。
百合科植物囊丝黄精(Polygonatum cyrtonema Hua.)是我国传统中草药，鲍锦库等在《生物化学杂志》(第12卷第2期，1996年4月)上发表的论文“黄精凝集素II的纯化及部分性质研究”介绍了一种黄精凝集素II，此种黄精凝集素II是一种酸性糖蛋白，以植物黄精块茎为原料，制备方法是对黄精块茎用生理盐水溶液浸取、硫酸铵沉淀后，将沉淀溶于蒸馏水，透析除盐，冷冻干燥获得黄精凝集素粗品，然后用猪甲状腺球蛋白-Sepharose 4B亲和柱分离纯化、用CM-Sepharose离子交换快速柱纯化、以CM柱的d峰进行SephadexG-100分子筛层析，获得四个蛋白峰，后三峰均有强凝集活性，分别命名为黄精凝集素I(PCLI)、黄精凝集素II(PCLII)、黄精凝集素III(PCLIII)，其中黄精凝集素II含量较多，经紫外和凝血活性检测，收集第II活性峰，透析除盐，冷冻干燥得黄精凝集素II蛋白。
鲍锦库等在《生物化学杂志》(第12卷第6期，1996年12月)上发表的论文“黄精凝集素II分子的稳定性与生物学活性研究”公开了黄精凝集素II对淋巴细胞的促有丝分裂活性，以广州产PHA为对照，黄精凝集素II对人外周淋巴细胞的转化率高达97.6％，细胞分裂比达18.3％，是一种极强的促有丝分裂源。
单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)是引起人类病毒性疾病中最常见的病毒，大多数人长期携带此病毒，以潜伏期感染的形式局限在某些感觉神经节内，受自身或环境因素诱发激活病毒，引起皮肤疱疹性损害。因此，抗HSV研究成为抗病毒研究的主要内容之一。目前国内外研究的抗HSV药物已有几十种，但是过渡到临床治疗HSV感染的药物仅无环鸟苷(ACV)较为有效，而且已经发现有不少耐药株发生，因此寻找新的抗HSV药物势在必行。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的方法制备黄精凝集素II蛋白，并证明黄精凝集素II蛋白对人类单纯疱疹病毒具有抑制作用，以便开发出一类新的药品。
本发明的技术方案采用细胞病变抑制法(CPE法，见Cotarelo M，CatalanP，Sanchez-Carrillo C，Menasalvas A，Cercenado E，Tenoriao A，Bouza E.Cytopathiceffect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpessimplex virus to antiviral agents.J Antimicrob Chemother，1999，44705~708.)和MTT法(见Campling BG，Pym J，Baker HM，Cole SP，Lam YM.Chemosensitivity testingof small cell lung cancer using the MTT assay.Br J Cancer，1991，63(1)75-83.)，以无环鸟苷注射剂(ACV)为阳性对照药物，研究黄精凝集素II蛋白抗单纯疱疹病毒(HSV)活性，证明了黄精凝集素II蛋白对人类单纯疱疹病毒具有很强的抑制作用。因此，可将黄精凝集素II蛋白制备成治疗或预防单纯疱疹病毒所致疾病的药品，用药方法可以通过口服、静脉内的注射等。
所述黄精凝集素II蛋白以植物黄精块茎为原料，采用工艺步骤依次为“粗品制备、亲和柱分离纯化、分子筛纯化”的方法获得。粗品制备是将黄精块茎切成片状以生理盐水溶液浸取，再经高速组织捣碎机捣成糊状以生理盐水溶液浸取，所得上清加入硫酸铵沉淀，将沉淀溶于蒸馏水，透析除盐，冷冻干燥即得黄精凝集素粗品；亲和柱分离纯化是将粗品溶于生理盐水溶液，透析平衡，离心除去不溶物，取上清液进行亲和层析，以甘露糖-Sepharose 4B为亲和吸附剂，以0.1～0.3mol/L甘露糖溶液解吸附，洗脱及解吸附过程中皆分部收集，收集管经280nm处测定紫外吸收后，将样品用生理盐水透析，以兔红细胞检查样品的凝集活性，合并活性部分并透析去盐，冷冻干燥得亲和层析样品；分子筛纯化以Sephacryl S-100柱为交换柱，将上述亲和层析样品用生理盐溶液溶解并透析平衡后上柱，用生理盐溶液洗脱，分部收集，经280nm处测定紫外吸收和检测活性后，收集活性部分，透析除盐，冷冻干燥即得到纯化的黄精凝集素II蛋白。
本发明的有益效果1、扩大了黄精凝集素II蛋白的应用范围，为治疗单纯疱疹病毒引起的病毒性疾病提供了一类新药。
2、相对于现有黄精凝集素II的装备方法，简化了工艺流程，缩短了制备时间，因而可降低制备成本。
3、亲和柱分离纯化时，甘露糖比现有技术中的甲状腺球蛋白特异性更高，分离效果更好，分子筛纯化时，分子筛S-100比现有技术中的G-100更快速，适于大规模、快速纯化。
图1是本发明所述黄精凝集素II蛋白的SDS-PAGE电泳图；图2是本发明所述黄精凝集素II蛋白抗单纯疱疹病毒II型(HSV-II)的活性结果图，图中，a正常细胞、bHSV-II引起的细胞病变、cde10，2.5，5μg/ml黄精凝集素II(PCLII)对细胞病变的抑制作用。
具体实施例方式
实施例1黄精凝集素II蛋白的制备本实施例中，黄精凝集素II蛋白的制备方法如下1 粗品制备将切成片状的黄精块茎以生理盐水溶液浸取(G/V＝1∶5)过夜，经高速组织捣碎机捣成糊状，生理盐水溶液浸取过夜，纱布过滤，离心(4℃，4500r/min，30min)，向上清中加入固体硫酸铵达30％饱和度，置4℃过夜，离心(4℃，4500r/min，30min)去沉淀，上清继续加硫酸铵至90％，离心收集沉淀，并将沉淀溶于蒸馏水，透析除盐，冷冻干燥得黄精凝集素粗品。
2 亲和柱分离纯化取粗品200mg溶于20ml生理盐水溶液，透析平衡，离心除去不溶物，取上清液进行亲和层析(柱2.6×40cm)。以甘露糖-Sepharose 4B为亲和吸附剂，用生理盐溶液平衡层析柱后，将上述凝集素粗品上柱，相同的生理盐溶液洗脱至流出液在280nm处吸收值小于0.02，换用0.2mol/L甘露糖溶液解吸附，洗脱及解吸附过程中皆分部收集，流速18ml/hr，3-4ml/管，收集管经280nm处测定紫外吸收后，将样品用生理盐水透析，以兔红细胞检查样品的凝集活性，合并活性部分并透析去盐，冷冻干燥得亲和层析样品。
3 分子筛纯化取经处理的Sephacryl S-100装柱(1.6×100cm)，用生理盐水平衡。将上述亲和层析样品用生理盐溶液溶解并透析平衡后上柱，用相同溶液洗脱，分部收集，流速为2ml/min，3ml/tube，经280nm处测定紫外吸收和检测活性后，收集活性部分，透析除盐，冷冻干燥得到纯化的黄精凝集素II，经SDS-PAGE检测为单一蛋白组分，见图1。
实施例2黄精凝集素II蛋白对人类单纯疱疹病毒的抑制作用1 材料和方法1.1 材料和仪器黄精凝集素II蛋白按实施例1所述方法制备而成。
细胞非洲绿猴肾细胞(Vero cell line)，四川大学华西医科部基础医学院提供细胞株。病毒单纯疱疹病毒II型(HSV-II)，333株，-70℃保存，由中国科学院武汉病毒研究所提供毒株。
培养基RPMI-1640(GIBCO产品)按照说明溶解，调节至pH7.2，微孔滤膜过滤除菌，加入小牛血清(成都哈里生物工程有限公司)至浓度为10％，含100U/ml青霉素(重庆药友制药有限责任公司)和100μg/ml硫酸链霉素(上海四药股份有限公司)。
胰蛋白酶GIBCO产品；MTT3-(4，5)-双甲基-乙-噻唑-(2，5)-二甲基溴化四氮唑蓝，Sigma产品；96孔板Nunclon产品。
阳性对照药物无环鸟苷注射剂(ACV)，丽珠集团湖北科益药业有限公司。
磷酸缓冲液PBS(不含Ca2+、Mg2+)为Na2HPO4和NaH2PO4配制成的浓度0.02M的水溶液，pH＝7.0，所用化学试剂为国产分析纯。
微孔滤膜φ25mm，孔径为0.22μm，上海医药工业研究院；酶标仪Model 550，Bio-Red产品。
所有的细胞培养用品经121～126℃高温高压灭菌30分钟后使用。
将待测样品用培养基溶解，其中不易溶解的样品则用少量二甲基亚砜(DMSO)助溶，过滤除菌，然后用培养基倍比稀释若干浓度，置于-20℃保存。
1.2 方法1.2.1 黄精凝集素II蛋白质浓度的测定用Folin-酚试剂测定，以牛血清白蛋白作标准。
1.2.2 非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)培养将培养瓶中长成单层的非洲绿猴肾细胞(Vero)用PBS洗3次，然后加入0.25％胰蛋白酶溶液1～2ml消化成单细胞，经细胞计数后，用培养基稀释成1×105cell/ml的细胞悬液，接种至96孔细胞培养板，每孔0.2ml，37℃，5％ CO2培养箱中培养24小时，待Vero细胞长成单层后进行实验。
1.2.3 单纯疱疹病毒II型(HSV-II)溶液的制备取冻存的HSV-II溶液一管，解冻后取0.2ml接种到长成单层细胞的10ml培养瓶中，37℃，5％CO2培养箱中吸附1个小时，用PBS洗去未吸附的病毒，加入新鲜培养基10ml，培养2～3天。观察细胞全部病变但尚未脱壁时，轻轻吸去上层培养基，加入新鲜培养基10ml，用滴管吹下细胞成细胞悬液，转移到10ml离心管中，置于-70℃冰箱反复冻融三次，4℃、4000rps离心15分钟，分装上清0.5ml/管，-70℃保存。
病毒滴定(细胞病变效应法)取-70℃冻存病毒液，室温解冻，用PBS连续10倍稀释6个浓度，接种到长成单层细胞的96孔板上，每个浓度作四个复孔，吸附1个小时，用PBS洗去未吸附病毒，加入新鲜培养基，37℃，5％CO2培养箱培养72小时后观察细胞病变效应。计算50％组织培养感染剂量(median tissue culture infection dose，TCID50)。
1.2.4 黄精凝集素II样品的细胞毒性实验CPE法待96孔板细胞长成单层后倾去培养基，按每个浓度4个复孔，每孔加入0.2ml经系列倍比稀释的黄精凝集素II溶液，对照孔加入新鲜培养基0.2ml，37℃，5％CO2培养箱继续培养72h，倒置显微镜下每日观察记录结果。
MTT法72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl，37℃，5％CO2培养箱继续培养4小时，可见蓝黑色甲瓒颗粒，轻轻吸去上清，加入0.2ml二甲亚砜，在振荡器上振荡5min，使甲瓒颗粒充分溶解，用酶标仪进行双波长(570及630nm)法测定吸光度值，按照Reed和Muench法计算药物对细胞的半数毒性浓度(CC50)。
1.2.5 黄精凝集素II样品的抗HSV-II活性实验待96孔板细胞长成单层后吸去培养基，取冻存病毒液，用PBS稀释100倍后，每孔加入稀释的病毒液20μl，置37℃，5％CO2培养箱中吸附1小时，吸去病毒液，按每个浓度3个复孔，每孔0.2ml加入经系列倍比稀释的黄精凝集素II样品溶液，同时阴性对照中加入新鲜培养基0.2ml、阳性药物对照中加入0.2ml的0.5mg/ml ACV、细胞对照中不加病毒液，只加0.2ml新鲜培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养72小时，镜检记录，同时用MTT法测定O.D值。按照Reed和Muench法计算药物对病毒的半数抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI)。
B＝log(＜50％样品浓度)C＝log(稀释倍数) 2 实验结果和讨论2.1 病毒毒力测定结果细胞病变效应法测得HSV-II的效价为TCID50＝1×10-4，使用时用PBS稀释100倍，按照病毒量为100×TCID50接种，每孔接种20微升。
2.2 黄精凝集素II的抗HSV-II活性研究2.2.1 用MTT法研究黄精凝集素II细胞毒性和抗HSV-II活性以5ug/ml ACV作为阳性对照，用MTT法研究黄精凝集素II细胞毒性和抗HSV-II活性，结果见表1和表2。
表1 黄精凝集素II的Vero细胞毒性结果浓度 细胞CC508 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625(mg/ml)对照mg/mlO.D平均值 0.453 1.145 1.214 1.245 1.220 1.291 1.301 1.312 1.350±s 0.02 0.03 0.01 0.04 0.030.03 0.020.040.025.29抑制率(％) 33.8 84.8 89.9 92.2 90.495.6 96.497.2表2 黄精凝集素II抗HSV-II活性结果病毒细胞 IC50浓度(ug/ml) 4 2 1 0.5 0.25 0.125对照对照 ug/mlO.D平均值 1.244 0.810 0.511 0.245 0.195 0.199 0.107 1.3461.45±s 0.330.280.12 0.140.09 0.110.050.03抑制率(％) 92.460.238.0 18.214.5 14.5
由表1可以，黄精凝集素II浓度在4mg/ml时，细胞病变抑制率(即细胞存活率)已经达到了84.8％，半数细胞毒性浓度为5.29mg/ml。5ug/ml ACV阳性对照的O.D平均值为1.222±0.05，细胞存活率为90.5％。从表2中结果可以看出，黄精凝集素II在浓度为4ug/ml时效果与5ug/ml ACV相当。其半数毒性浓度(CC50)为5.29mg/ml，半数抑制浓度(IC50)为1.45ug/ml，其治疗指数TI为3648.3，表明黄精凝集素II治疗安全性好。
2.2.2 细胞病变抑制法(CPE)测定黄精凝集素II蛋白抗HSV-II活性结果用培养基将黄精凝集素II蛋白配成1mg/ml浓度溶液，过滤除菌，并稀释成相应浓度，进行细胞毒性和抗HSV-II活性研究。
●黄精凝集素II蛋白的细胞毒性经过72h的观察，黄精凝集素II蛋白在10-1-10-6稀释度下均未出现细胞病变，表明黄精凝集素II在这些浓度下无细胞毒性，结果见表3。
表3 黄精凝集素II对Vero细胞的毒性孔 PCLII(1000ug/ml)溶液稀释倍数 细号 胞10-110-210-310-410-510-61- - - - - - -2- - - - - - -3- - - - - - -注“-”表示无细胞病变；“+”表示25％左右的细胞病变；“++”表示50％左右的细胞病变；“+++”表示75％左右的细胞病变；“++++”表示100％的细胞病变。(下同)●黄精凝集素II蛋白抗HSV-II实验结果细胞接种病毒并加入含黄精凝集素II蛋白的培养基后，每日观察、记录细胞病变状况。72小时后，细胞空白对照组未出现病变，阴性对照组出现显著的细胞病变，阳性对照药物组未出现细胞病变，结果见表4、表5、表6和图2。
表4 ACV抗HSV-II实验结果孔号 AVC浓度(ug/mL)500 100 50 25 12.5 6.251-----+2-----+3-----+
表.5 PCLII抗HSV-II实验结果孔号PCLII浓度(ug/ml) 细胞10 52.5 1.25 0.6250.3125 HSV-II1-+++++ +++ ++++++++-2-+++ ++++++ ++++++++-3--++++++ ++++++++-表6 黄精凝集素II抗HSV-II活性结果样品 最高无细胞毒浓度(TC)最低抗病毒活性浓度(IC)TC/IC黄精凝集素II 1000ug/ml 0.625ug/ml 1600(PCLII)从表5结果可以看出，当黄精凝集素II浓度大于10ug/mL时完全抑制HSV-II引起的Vero细胞病变。随黄精凝集素II浓度的降低，开始发生细胞病变，黄精凝集素II样品浓度为1.25ug/mL时约有50％左右细胞发生了病变，有部分抗HSV-II活性，IC50在1.25-2.50ug/ml之间。其最高无细胞毒性结果和最低抗HSV-II活性结果如表6。样品的最高无细胞毒浓度(TC)越大，则样品的细胞毒性越小；最低抗病毒活性浓度(IC)越小，则抗病毒效果越强。TC/IC是评价样品潜在的抗病毒安全性的一个大致指标，TC/IC越大，则该样品安全高效。从表6中可以看出，黄精凝集素II样品的TC/IC为1600，二者相差1600倍，表明黄精凝集素II是一种有效的体外抗HSV-II糖结合蛋白。
采用MTT法和CPE法测定黄精凝集素II抑制HSV-II对Vero细胞感染的作用，得出的结论一致，IC50分别为1.45ug/ml和1.25ug/ml，CC50为5.29ug/ml，表明黄精凝集素II在低浓度下即可有效抵抗HSV-II对正常细胞的感染，并且黄精凝集素II对Vero细胞的毒性很低，其治疗指数高达3460，TC/IC值也达到1600，说明黄精凝集素II是一种低毒高效的体外抗HSV-II的生物活性糖结合蛋白。由于黄精凝集素II是一种糖结合蛋白，可以和HSV-细胞表面的糖链相互结合，从而封闭或阻断HSV-II与宿主细胞的识别和结合并降低感染，具有抗人类II型单纯疱疹病毒临床应用价值。
权利要求
1.黄精凝集素II蛋白在制备治疗或预防单纯疱疹病毒所致疾病的药中的应用。
2.权利要求1所述的黄精凝集素II蛋白，以植物黄精块茎为原料，采用以下工艺步骤制备而成(1)粗品制备粗品制备是将黄精块茎切成片状以生理盐水溶液浸取，再经高速组织捣碎机捣成糊状以生理盐水溶液浸取，所得上清加入硫酸铵沉淀，将沉淀溶于蒸馏水，透析除盐，冷冻干燥即得黄精凝集素粗品，(2)亲和柱分离纯化亲和柱分离纯化是将粗品溶于生理盐水溶液，透析平衡，离心除去不溶物，取上清液进行亲和层析，以甘露糖-Sepharose 4B为亲和吸附剂，以甘露糖溶液解吸附，洗脱及解吸附过程中皆分部收集，收集管经280nm处测定紫外吸收后，将样品用生理盐水透析，以兔红细胞检查样品的凝集活性，合并活性部分并透析去盐，冷冻干燥得亲和层析样品，(3)分子筛纯化分子筛为Sephacryl S-100柱，将上述亲和层析样品用生理盐溶液溶解并透析平衡后上柱，用生理盐溶液洗脱，分部收集，经280nm处测定紫外吸收和检测活性后，收集活性部分，透析除盐，冷冻干燥即得到纯化的黄精凝集素II蛋白。
3.根据权利要求2所述的黄精凝集素II蛋白，其特征在于亲和柱分离纯化时解吸附所用的甘露糖溶液的浓度为0.1～0.3mol/L。
全文摘要
一种黄精凝集素II蛋白，以植物黄精块茎为原料，制备工艺步骤依次为粗品制备、亲和柱分离纯化和分子筛纯化。亲和柱分离纯化以甘露糖－Sepharose 4B为亲和吸附剂，以甘露糖溶液解吸附；分子筛为Sephacryl S－100柱，将亲和层析样品用生理盐溶液溶解并透析平衡后上柱，用生理盐溶液洗脱，分部收集，经280nm处测定紫外吸收和检测活性后，收集活性部分，透析除盐，冷冻干燥即得到纯化的黄精凝集素II蛋白。本发明采用CPE法和MTT法，以ACV为阳性对照药物，研究黄精凝集素II蛋白抗单纯疱疹病毒(HSV)活性，证明了黄精凝集素II蛋白对人类单纯疱疹病毒具有很强的抑制作用，以便开发出一类新的药品。
文档编号A61P31/00GK1562350SQ20041002235
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月20日 优先权日2004年4月20日
发明者吴传芳, 常丽青, 荣艳珍, 高顺, 赵曦, 陈放, 鲍锦库 申请人:四川大学