一种凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及一种凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] 凝集素是生物体中能够与糖链物质特异性识别并结合的一类蛋白质分子。在生物 体中，凝集素的功能涉及细胞与细胞间的识别与交流，细胞信号的传导，病原体的侵染及其 与宿主间的相互作用，疾病的发生及免疫系统的调节等方面。凝集素在医学上被广泛用于 抗病毒药物的研发，在农业生产领域，也可被用作抵抗病虫害的生物制剂等。
[0003] 在病毒侵染宿主过程中，病毒糖蛋白与宿主细胞受体蛋白间的识别与互作是介导 病毒进入宿主细胞的第一步。研究表明，一些凝集素分子能够竞争性结合病毒表面的糖蛋 白，而减少和抑制其与宿主细胞表面受体蛋白间的结合，从而阻止病毒侵染宿主细胞。凝集 素与病毒糖蛋白间的结合效力越强，对病毒侵染宿主细胞的抑制能力也就越强，而凝集素 与糖蛋白间的结合效力与凝集素分子上具有的糖链结合位点数相关，即糖链结合位点数越 多，其结合糖蛋白的能力也越强。
[0004] 此前已有研究发现来自于Microcystis aeruginosa的凝集素 microvirin(MVN)具 有较强的抵抗艾滋病病毒(HI V)侵染的能力，MVN可以特异性的结合含甘露糖结构的糖链， 且该凝集素单体蛋白上仅有一个糖链结合位点，因此，如果构建具有多个MVN单体的凝集素 寡聚复合体蛋白，将会使其分子具有更多的糖链结合位点，从而增强其结合病毒和阻抑病 毒侵染宿主细胞的能力。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是应用分子生物学与基因工程技术，提供一种新的凝集素蛋白寡聚 复合体的构建方法。
[0006] 本发明的另一目的是提供上述方法构建的凝集素蛋白寡聚复合体。
[0007] 本发明的又一目的是利用上述凝集素蛋白寡聚复合体构建方法构建的凝集素蛋 白寡聚复合体在实际中的应用。
[0008] 本发明的目的可通过如下技术方案来实现：
[0009] -种凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法，将至少两个凝集素蛋白单体的核酸序列 克隆并串联连接至蛋白表达载体的多克隆位点中构建凝集素蛋白寡聚复合体的重组表达 载体，由所述重组表达载体进行表达获得凝集素蛋白寡聚复合体。上述的凝集素为包含MVN 在内的所有类型的凝集素。本发明所述的构建方法适用于所有凝集素的蛋白寡聚复合体的 构建，并不仅限于MVN。
[0010]优选的，所述的凝集素蛋白寡聚复合体为凝集素蛋白单体按串联顺序排列的凝集 素蛋白二聚体、凝集素蛋白三聚体、凝集素蛋白四聚体及四个以上凝集素蛋白单体组成的 复合体，且各凝集素蛋白单体之间具有间隔序列。
[0011] 所述凝集素蛋白二聚体的重组表达载体为将两个凝集素蛋白单体的核酸序列插 入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI和Xhol三个酶切位点之间，所述凝集素蛋白三聚体的重组 表达载体为将三个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI、Ec 〇rI 和Xhol四个酶切位点之间，所述凝集素蛋白四聚体的重组表达载体为将四个凝集素蛋白单 体的核酸序列插入到蛋白表达载体的Ndel、BamHI、EcorI、SacI和Xhol五个酶切位点之间。
[0012] 所述的凝集素蛋白二聚体为MVN-D i 2、MVN-D i 6和MVN-D i 10;所述的凝集素蛋白三 聚体为^1^2、]\^^1^6和醫11^10;所述的層~四聚体为層1^^杜32，]\^1^^杜&6和 MVN-TetralO；
[0013] 上述各凝集素蛋白寡聚复合体的重组表达载体的构建过程为：
[0014] 表达所述凝集素蛋白二聚体MVN-Di2的重组表达载体：以SEQ ID No.l所示的MVN 基因序列为模板采用两对引物MVN-Ndel For/MVN-BamHI2 Rev、MVN-BamHI2 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有Ndel和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和Xhol酶切 位点的目的基因片段，将带有Ndel和BamM酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET-30a载体，构建MVN-Di2中间载体I;将带有BamHI和Xho頂每切位点的目的基因片段双酶切后 连接至MVN-Di 2中间载体I构建成表达所述二聚体MVN-Di 2的重组表达载体；
[0015] 表达所述凝集素蛋白二聚体MVN-Di6的重组表达载体：以SEQ ID No.l所示MVN基 因序列为模板采用两对引物MVN-Ndel For/MVN-BamHI6 Rev、MVN-BamHI6 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有Ndel和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和Xhol酶切 位点的目的基因片段，将带有Ndel和BamM酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET-30a载体，构建MVN-Di6中间载体I;将带有BamHI和Xho頂每切位点的目的基因片段双酶切后 连接至MVN-D i 6中间载体I构建成表达所述二聚体MVN-D i 6的重组表达载体；
[0016] 表达所述凝集素蛋白二聚体MVN-Diio的重组表达载体：以SEQ ID No.l所示MVN基 因序列为模板采用两对引物MVN-Ndel For/MVN-BamHI 10 Rev、MVN-BamHI 10 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有Ndel和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和Xhol酶切 位点的目的基因片段，将带有Ndel和BamM酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET-30a载体，构建MVN-DilO中间载体I;将带有BamHI和Xhol酶切位点的目的基因片段双酶切后 连接至MVN-Di 10中间载体I构建成表达所述二聚体MVN-Di 10的重组表达载体；
[0017] 表达所述凝集素蛋白三聚体MVN-Tri2的重组表达载体：以SEQ ID No.l所示MVN基 因序列为模板采用两对引物MVN-BamHI2 For/MVN-EcorI2 Rev、MVN-EcorI2 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有BamHI和EcoH酶切位点的目的基因片段和带有Ecorl和Xhol酶 切位点的目的基因片段，将带有BamHI和Ecorl酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述 的MVN-Di 2中间载体I，构建MVN-Tr i 2中间载体Π ，将带有Ecor I和Xho頂每切位点的目的基因 片段酶切后连接至MVN-Tri2中间载体Π ，构建成表达所述三聚体MVN-Tri2的重组表达载 体；
[0018] 表达所述凝集素蛋白三聚体MVN-Tri6的重组表达载体：以SEQ ID No.l所示MVN基 因序列为模板采用两对引物MVN-BamHI6 For/MVN-EcorI6 Rev、MVN-EcorI6 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有BamHI和EcoH酶切位点的目的基因片段和带有Ecorl和Xhol酶 切位点的目的基因片段，将带有BamHI和Ecorl酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述 的MVN-Di 6中间载体I，构建MVN-Tr i6中间载体Π ，将带有Ecor I和Xho頂每切位点的目的基因 片段酶切后连接至MVN-Tri6中间载体Π ，构建成表达所述三聚体MVN-Tri6的重组表达载 体；
[0019] 表达所述凝集素蛋白三聚体MVN-TrilO的重组表达载体：以SEQ ID No.l所示MVN 基因序列为模板采用两对引物MVN-BamHI 10 For/MVN-Ecorl 10 Rev、MVN-EcorI 10For/MVN-Xhol Rev进行扩增分别获得带有BamHI和EcoH酶切位点的目的基因片段和带有Ecorl和 Xhol酶切位点的目的基因片段，将带有BamHI和Ecorl酶切位点的目的基因片段酶切后连接 至所述的MVN-Di 10中间载体I，构建MVN-Tr i 10中间载体Π ，将带有Ecor I和Xho頂每切位点的 目的基因片段酶切后连接至MVN-TrilO中间载体Π ，构建成表达所述三聚体MVN-TrilO的重 组表达载体；
[0020] 表达所述凝集素蛋白四聚体MVN-Tetra2的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN 基因序列为模板采用两对引物MVN-EcorI2 For/MVN-SacI2 Rev、MVN-SacI2 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和Xhol酶切 位点的目的基因片段，将带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的 MVN-Tri2中间载体Π ，构建MVN-Tetra2中间载体ΙΠ ，将带有SacI和Xhol酶切位点的目的基 因片段酶切后连接至MVN-Tetra2中间载体ΙΠ ，构建成表达所述四聚体MVN-Tetra2的重组表 达载体；
[0021] 表达所述凝集素蛋白四聚体MVN-Tetra6的重组表达载体：以SEQ ID No.l所示MVN 基因序列为模板采用两对引物MVN-EcorI6 For/MVN-SacI6 Rev、MVN-SacI6 For/MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和Xhol酶切 位点的目的基因片段，将带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的 MVN-Tri6中间载体Π ，构建MVN-Tetra6中间载体ΙΠ ，将带有SacI和Xhol酶切位点的目的基 因片段酶切后连接至MVN-Tetra6中间载体ΙΠ ，构建成表达所述四聚体MVN-Tetra6的重组表 达载体；
[0022] 表达所述凝集素蛋白四聚体MVN-TetralO的重组表达载体：以SEQ ID No.l所示 MVN基因序列为模板采用两对引物MVN-EcorI10 For/MVN-SacI10 Rev、MVN-SacI10 For/ MVN-XhoI Rev进行扩增分别获得带有EcorI3和Sac頂每切位点的目的基因片段和带有SacI 和Xhol酶切位点的目的基因片段，将带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连 接至所述的MVN-Tri 10中间载体Π ，构建MVN-TetralO中间载体ΙΠ ，将带有