布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶和AB5毒素β亚基的嵌合体的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及嵌合多肽，所述嵌合多肽作为用于在哺乳动物中诱导针对志贺毒素 (Shiga toxin，Stx)的保护性免疫应答以及中和抗体的免疫原有用。具体而言，本发明涉及 嵌合多肽以及由所述嵌合多肽形成的寡聚蛋白复合体，所述嵌合多肽包含与布鲁氏菌属 (Brucella)2,4-二氧四氢蝶啶合酶(lumazine synthase)的单体的N末端融合的志贺2毒素 的同五聚体(homopentameric)B亚基的单体。本发明还涉及编码所述嵌合多肽的多核苷酸 和载体、包含所述多核苷酸和载体的转基因细胞、以及包含所述嵌合多肽和嵌合多核苷酸 的药物组合物(如疫苗）。结合本发明的嵌合多肽的抗体、用于获得特异性结合志贺2毒素的 B亚基的抗体的方法以及降低哺乳动物中肠出血性大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌负 荷(bacterial load)的方法(所述方法可用于预防特别是溶血性尿毒综合征(HUS))也在本 发明的范围内。
【背景技术】
[0002] 肠出血性大肠杆菌(EHEC)菌株是人类重要的食源性致病菌(Kaper等，2004. Nat Rev Microbiol 2:123-140) AHEC感染的临床表现从水样腹泻或出血性结肠炎(HC)至最严 重的结果，即危及生命的溶血性尿毒综合征(HUS) (Karmali 1989. Cl in Microbiol Rev 2: 15-38)。感染与受污染的肉或蔬菜的摄取相关，但也通过水或者甚至人对人的接触传播 (Caprioli等，2005.Vet Res 36:289-311;Griffin和Tauxe，1991.Epidemiol Rev 13:60-98)。在一些发达国家中报道了零星或大规模爆发。在其它国家(如阿根廷），HUS显示出地方 性特性，并表现为具有高发病率和死亡率值的严重公共卫生问题（Lopez等，2000.1 nfect Dis Clin North Am 14:41_65，viii;Rivas等，2006.Medicina(B Aires)66Suppl 3:27-32)〇
[0003] EHEC感染的显著特点是强有力的志贺毒素的产生，对HUS发展负有责任(Noe I和 Boedeker,1997.Dig Dis 15:67-91;0'brien等，Curr Top Microbiol Tmmunol 180:65-94)。志贺毒素家族是一组在结构上和功能上相关的AB5外毒素(exotoxins)，包括由痢疾志 贺氏菌（Shigella dysenteriae)血清型1生产的志贺毒素（Stx)和由肠出血性大肠杆菌 (EHEC)菌株生产的志贺毒素。EHEC可生产两类Stx，志贺毒素1型（Stxl)和志贺毒素2型 (Stx2)以及它们的等位基因变体(allelic variants)。志贺毒素的基因由溶原性λ形细菌 菌体编码(Schmidt，2001 .Res Microbiol 152(8) :687_95)，并且给定细菌可表达多于一 种Stx，因为它们可能包含多于一种编码Stx的细菌噬菌体。
[0004] 所有志贺毒素家族成员均具有AB5*子构型（Stein等，1992.Nature 355(6362): 748_50;Fraser等，1994.Nat Struct Biol 1(1):59_64)，其中，酶促活性单体A亚基StxA (具有32kDa的分子量)与负责结合细胞表面受体的B亚基StxB非共价缔合。StxB是一个同五 聚体蛋白（相同单体的五聚体，各单体具有7.7kDa的分子量）JtxB形成具有中央孔的环状 结构，StxA的駿基末端插入到其中（Fraser等，1994.Nat Struct Biol 1(1) :59_64)。3七叉八 亚基和StxB亚基均被分泌到细菌周质中，在细菌周质中它们非共价组装成全毒素，如最初 描述的来自大肠杆菌的不耐热肠毒素（Hirst等，1984.Proc Natl Acad Sci U S A 81 (24):7752-6)。
[0005] StxA具有高度特异性的RNA N-糖苷酶活性，切割位于真核生物核糖体的28S核糖 体1^4(>1^4)￥1结构域上的€[-8&1^;[11环上的4,324位的腺噪呤碱基，从而抑制延伸因子依赖 性的氨酰tRNA结合和随后的链延长(Endo等，1988.Eur J Biochem 171(1-2):45-50)。细菌 核糖体也是StxA的底物，并且，暴露于志贺毒素1型（Stxl)导致敏感细菌的增殖减少（Suh 等，1998 ·Biochemistry 37(26): 9394-8)。
[0006] StxA亚基由通过二硫桥连接的两个片段组成，所述StxA亚基在胞质和内质网中由 酶进行蛋白水解切割，从而生成27kDa的Al亚基（负责酶活性）并释放出较小的A2片段 (Garred等，1995.J Biol Chem 270(18):10817-21)<^113^11 和合作者显示出，虽然StxA和 StxB可在体外自发形成全毒素，重组Al片段不能结合StxB，这表明片段A2对全毒素的组装 至关重要(Austin等，1994. Infect Tmmun 62(5): 1768-75)。
[0007] StxA负责毒性作用，而StxB五聚体负责结合真核细胞中的特异性受体。StxB结合 中性糖鞘脂神经酰胺三己糖苷（81〇13〇1：1^3〇871〇6抑111丨(16,6&3;也称为0(177或?1^血型抗原） (Gb3存在于细胞表面上（Jacewicz等，1986. J Exp Med 163(6) :1391_404;Lindberg等， 1987.J BiolChem 262(4):1779-85;Waddell等，1990.Proc Natl Acad Sci U S A 87 (20): 7898-901))，导致毒素随后的内化（internalization)。在没有StxA的情况下，StxB仍 采用五聚体结构，在结合受体的能力方面该五聚体在功能上等同于全毒素(Donohue-Rolfe 等，1989.Mol Microbiol 3(9): 1231-6)。每个B亚基单体包含两个三链反向平行β折叠和一 个α螺旋。所述五聚体形成具有直径为约IlA的中央孔的环状结构，该环状结构由五个α螺 旋界定并被来自成对的相邻单体的β折叠包围，形成六链反向平行β折叠（Stein等， 1992.Nature 355(6362):748-50)。
[0008] 与受体Gb3三糖类似物复合的志贺毒素1的B亚基(Stxl B)的晶体结构解析揭示了 B 亚基的各单体内的三个潜在结合位点（称为位点1、位点2和位点3) (Ling等， 1998.Biochemistry 37(7): 1777-88)。因此，在StxB五聚体中有15个Gb3结合位点。所有15 个Gb3结合位点面向相同方向，远离A亚基，从而鉴定出五聚体中的膜相互作用表面。无论是 直接地还是经由构象变化，Gb3结合位点彼此均不相互作用。
[0009] 位点1位于相邻的B亚基之间的槽中，其特征在于Phe-30的苯环与受体的Gaie之间 的疏水相互作用以及涉及48?-17、11^-21、6111-28和61 7-60的氢键。位点2位于?116-30的苯 环相对侧的缝隙（crevice)中，所述缝隙由Gly-63、Asn-32、Arg-33和Ala-56所限定。第三结 合位点涉及GalP针对Trp-34(位于StxlB的中央孔周围的α螺旋中）的(I引噪环的疏水堆积相 互作用以及Gala和相邻单体的Trp-34之间的疏水相互作用。此外，Gala氢键合来自相邻单 体的Trp34和Asn35以及Aspl8。从这些结果可以推断出，至少位点1和位点3需要五聚体的正 确组装以具有功能。关于StxlB的突变研究表明，位点1和位点2介导高亲和力相互作用； Stxl细胞毒活性主要由Gb3结合位点1和位点2介导。然而，位点3介导低亲和力相互作用 (Bast等，1999 .Mol Microbiol 32(5): 953-60)。虽然位点3的亲和力可能太低，以至于无法 显著促进细胞结合强度，Ling和合作者提出，它可能用于其它目的。这一观点的一个原因在 于如下事实:34位的色氨酸残基是保守的，尽管其完全暴露于溶剂。这些作者提出，位点3可 能发挥帮助在毒素下的膜中螯合（sequester)更大数量的Gb3分子的作用（Ling等， 2000. Structure 8(3): 253-64)。因此，所有三个寡糖结合位点对于完整生物活性而言均是 必需的。
[0010]由于难以表达大量生物活性形式，Stx2B的研究受到了阻碍（Acheson等， 1995. Infect Immun 63(1):301-8)。但是，Stx2的晶体结构分析预测出在其B亚基上存在相 应的三糖结合位点，但也证明了位点2的构象与来自志贺氏菌的志贺毒素及StxlB亚基的构 象显著不同（Fraser等，2004. J Biol Chem 279(26) :27511-7)。然而，涉及糖结合的残基在 志贺毒素家族中要么是保守的，要么是保守置换的（Ling等，2000. Structure 8(3): 253-64)。一个例外是Stx2B位点2中的Glul6置换了StxlB中的天门冬氨酸(在StxlB中，所见到的 关于Glul6的水介导的氢键被替换为关于Aspl6的直接相互作用）。这种置换可能对志贺毒 素2及其变体的降低的Gb3亲和力负有部分责任。
[0011] 定点诱变显示，保守残基Gly60对于Stxl和Stx2的细胞毒性而言是必不可少的。该 残基的置换将改变β5-β6环的构象，β5-β6环不仅涉及位点1、还涉及位点2(Perera等， 1991.J Bacteriol 173(3): 1151-60)。定点诱变还显示，Arg33在Stxl和Stx2的细胞毒性中 发挥重要作用。该结果可以由以下内容解释:Arg33的侧链广泛参与位点2中与Gb3三糖的末 端半乳糖的氢键键合(Ling等，2000 · Structure 8(3): 253-64) 〇
[0012] 志贺毒素家族的原型为由痢疾志贺氏菌产生的Stx，该Stx与由大肠杆菌产生的 Stxl几乎相同，区别在于催化亚基中的单个氨基酸（O' Loughl in和Rob in s-Browne， 2001 .Microbes Infect 3(6) :493-507) C3Stxl和Stx2均有不同的变体，Stx2为最多样的。 3七叉1家族由3七11和5七11(：组成，而3七12包括变体3七12(3、3七12〇2、3七12(1、3七12(1可活隱、3七126和 StxSfc3Stxl和Stx2在氨基酸序列水平上仅具有56%的一致性(Jackson等，1987 . Microb Pathog 2(2): 147-53) <^?χ2变体与Stx284-99% 同源。
[0013] 虽然Stxl和Stx2之间在它们的基本结构、受体识别和作用的生化机制上存在显著 相似性，感染了产Stxl、Stx2或这两者的EHEC菌株的患者的临床影响具有相当大的差异。原 则上，将预测Stxl和Stx2都会使患者陷入发展为HUS的风险。然而，大量流行病学研究显示， 相比产Stxl菌株或产两种毒素的菌株，产Stx2菌株与HUS发展联系更频繁（Scotland等， 1987.Epidemiol Infect 99(3):613-24;0stroff等，1989.J Infect Dis 160(6):994-8; Donohue-Rolfe等，2000.J Infect Dis 181(5):1825-9)〇
[0014] 关于Stxl和Stx2之间的差异，其中最显著的差异在于对于Gb3受体的亲和力和诱 导毒性的能力方面的差异。虽然Stxl和Stx2具有相同的功能性受体，对于Gb3，Stxl具有相 比Stx2而言 10倍更高的亲和力（Head等，1991 .Biol Chem 266(6): 3617-21)。使用BIAcore 系统进行的研究显示，尽管Stxl与Gb3缔合的速率高于Stx2，Stx2从受体的解离慢于Stxl， 这说明虽然Stx2与受体结合较慢，但它也以较慢的速率解离(Nakajima等，2001.J Biol Chem 276(46):42915-22)。
[0015] 尽管Stxl对于Gb3的亲和力较高，与流行病学研究一致的是，Stx2具有低于 StxHOO倍的50%小鼠致死剂量(LD5Q)(Tesh等，1993.Infect Immun 61 (8):3392-402)。当 将人肾微血管内皮细胞用Stxl或Stx2处理时也获得了类似结果，发现Stx2具有约1000倍高 的毒性(Louise和Obrig，1995 J Infect Dis 172(5): 1397-401)。不同的研究已弄清楚了， B亚基是体内Stxl和Stx2的差异毒性的关键确定因素。在无细胞体外翻译抑制分析中，Stxl 和Stx2A亚基的毒性是无法区分的，这表明这些亚基的酶活性不负责这两种毒素之间的巨 大体内差异。相反，对野生型Stx毒性和嵌合Stx毒性进行比较的动物模型证明了，Stx2B亚 基的存在是体外和体内致死性的关键决定因素(Weinstein等，1989. Infect Immun 57 (12):3743-50;Head等，1991.Biol Chem 266(6):3617-21;Lingwood，1996.Trends Microbiol 4(4):147-53;Marcato等，2003.Infect Immun 71(10):6075-8)〇
[0016] 使用质谱技术，Kitova等报道了在5-85μΜ的亚基浓度范围，StxlB主要是五聚体， 不依赖离子强度（Kitova等，2005. J Am Soc Mass Spectrom 16(12) :1957_68;Kitova等， 2009.Biochemistry 48(23): 5365-74)。这些数据得到显示出高度热稳定五聚体的StxlB的 圆二色性（CD)和动态扫描量热（DSC)研究的支持(Pina等，2003.Biochemistry 42(31): 9498-506)。相反，Stx2B亚基的组装程度强烈依赖于温度、亚基浓度和离子强度。在亚基浓 度大于50μΜ时，虽然也明显存在较小的多聚体(二聚体、三聚体和四聚体），Stx2B亚基主要 作为五聚体存在。在较低浓度时，Stx2B亚基主要作为单体和二聚体存在。Conrady和合作者 在直接溶液状态技术中确认并定量了 Ki tova等（2005)所观察到的差异。这些作者报道， Stx2B五聚体在pH 7.4的溶液中的稳定性比StxIB五聚体低约50倍(Conrady等，2010 .PLoS One 5(12):el5153)〇
[0017] 在免疫水平上观测到Stxl和Stx2之间的另一重要差异。尽管这两种类型的Stx的 初步鉴定是由于针对一个变体的抗体并不与另一变体交叉反应，这两种毒素之间的交叉反 应性（以及交叉中和）的研究是多年的争论主题。体外研究表明，这两种毒素在血清学上不 同，并且针对一种毒素的抗体并不能中和另一种毒素(Scotland等，1985.Lancet 2(8460): 885-6 ;Karmali等，1986 · Lancet 1 (8473): 164-5; Strockbine等，1986 · Infect Tmmun 53 (1): 135-40)。类似地，Wen等显示，用遗传灭活的Stxl或Stx2类毒素进行的小鼠免疫能够产 生针对同源毒素但不针对异源毒素的抗毒素血清IgG，并且，这些抗体提供了对抗仅用同源 毒素进行的激发(challenge)的特异性保护性免疫(Wen等，2006.Vaccine 24(8): 1142-8)。 然而，在用Stxl或Stx2的类毒素制剂免疫的动物的其它研究中，由于产生了针对A亚基的抗 体，动物显示出对抗用任一种毒素进行的激发的交叉保护。Bielaszweska等发现，用化学灭 活的Stxl或Stx2类毒素、或各毒素的A亚基进行的兔免疫防止了在由毒素介导的全身病变 (systemic pathology)的发展期间革El组织中的异源毒素定位（localization)。在这项研究 中，Stxl或Stx2的B亚基并未提供异源保护(Bielaszewska等，1997 · Infect Tmmun 65(7): 2509-16)儿1!(1?18等报道了体内交叉保护的进一步证据，其中，通过用化学灭活的Stx2类毒 素进行免疫，获得了对抗Stxl激发的兔保护(Ludwig等，2002.Can J Microbiol 48(1) :99-103)。
[0018] Stx的B亚基之间的交叉反应性也有争议。一些研究表明，针对Stxl或Stx2的B亚基 的抗体不提供交叉保护（Wadolkowski 等，1990.1nfect Immun 58(12) :3959_65; BieIaszewska等，1997 · Infect Tmmun 65(7): 2509-16)。由于这个原因，一些作者提出了使 用Stx2B和StxlB之间的融合蛋白来提供对抗这两种毒素的保护(Gao等，2009. Vaccine 27 (14): 2070-6; Zhang 等，2011 .Vaccine 29(22): 3923-9)。然而，Tsuji 等报道了，用构建体 Stx2B-HIS(具有组氨酸标签的Stx2B)进行的小鼠鼻内免疫能够赋予对抗Stxl的交叉保护， 但反过来却行不通(Tsuji等，2008 · Vaccine 26( 17): 2092-9)。
[0019] Stx2变体可通过生物活性、免疫反应性或受体特异性方面的差异来区分。Stx2及 其变体优先结合Gb3糖鞘脂；Stx2e例外，Stx2e优先结合g lobotetraosy lcerami de(Gb4) (Lingwood，1996 · Trends Microbiol 4(4): 147-53) eStx〗和Stx2c是毒力最强的Stx2变体， 并与大多数HUS病例有关(Boerlin等，1999. J Clin Microbiol 37(3) :497-503);而Stx2e 为唯一一个不与人的HUS和出血性结肠炎相关的变体，其反而负责猪的水肿病(MacLeod等， 1991.Vet Pathol 28(1) :66-73)。此外，Stx2d可活_与所有其它类型的Stx的不同之处在于 它可被弹性蛋白酶(肠粘液的一种组分，切割A亚基的最后两个残基从而释放出片段A2)活 化（Scheiring等，2008.Pediatr Nephrol 23(10):17