II限制性酶对pETlla-BLS质粒和纯化的 基因进行消化，并在16°C用DNA T4连接酶进行连接。将连接物转化到大肠杆菌DH5a感受态 细胞中，并利用特异性引物(正向和反向10)通过PCR对菌落进行筛选。通过测序确认插入。 测序分析显示，布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的前8个氨基酸被来自Stx2B蛋白的70个 氨基酸（Seq. ID. No. 1)替换。由此获得了编码具有Seq. ID. No. 5的嵌合融合蛋白（称为BLS-Stx2B(L10))的基因。
[0129] 实施例5
[0130] 通过以下方案构建pCI-neo_BLS-Stx2B-L10质粒：
[0131] 将克隆在pETl Ia载体中的BLS_Stx2B(L10)的基因序列Seq. ID. No. 6亚克隆到载体 pCi-neo(Promega，USA)中。因此，制备以下寡核苷酸以用作PCR中的引物：
[0132] BLS-DNA-嵌合体alI (Seq · ID · No · 16):
[0133] 5'GTTTAA GAATTCGAAGGAGATACCACCATGCAT 37
[0134] BLS-Back(Seq.ID.No.l7)：
[0135] 37 CGTAGCGCGAACAGACTCGATCGTACTGACCACCTGT 57
[0136] 引物BLS-DNA-嵌合体all添加了用于EcoRI酶的限制性位点（粗体)和Kozak共有序 列（下划线）;BLS-Back引物添加了用于Nhe頂每的限制性位点(粗体）。
[0137] 使用pETlla-BLS-Stx2B(L10)质粒作为模板，通过PCR来扩增此类序列。如实施例3 所述的进行PCR。如实施例3所述的，将PCR产物用EcoR頂每和NheI酶进行消化，并将pCI-neo 载体用EcoRI和XbaI进行消化。然后，如实施例2 (C)中所述的实施连接反应(Nhe I和XbaI酶 具有兼容的末端）。将连接物转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，并利用特异性引物(BLS- DNA-嵌合体all/BLS-Back以及正向/反向10)通过PCR对菌落进行筛选。通过测序对获得的 构建体进行检查。在大肠杆菌DH5a细胞中对pCI-ne〇-BLS-StX2B(L10)质粒进行扩增，并进 一步通过"mini prep"柱(Qiagen，UK)进行纯化。DNA的纯度和浓度通过分光光度计在260/ 280nm处进行评估。
[0138] 实施例6
[0139] 通过以下方案构建含有具有SEQ ID.No.8的基因的pETlla-BLS-Stx2B(具有15个 氨基酸的接头)质粒：
[0140] a)为了克隆布鲁氏菌属的2,4_二氧四氢蝶啶合酶(BLS)的编码基因，利用特异性 引物通过PCR扩增从流产布鲁氏菌的基因组DNA获得BLS序列，并克隆到pETl Ia载体 (Novagen，USA)中。为了开发表达盒，对编码布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)的开 放阅读框的序列进行定向诱变(Laplagne等，2004,Proteins 57:820-828)。在BLS基因的5' 区域中插入两个新的限制性位点：位于5'端的前两个密码子中的NsiI位点；以及位于包含 BLS天然氨基酸序列的第8位和第9位残基的两个密码子中的一个Afl II位点。
[0141] b)为了将所编码的序列插入Stx2B蛋白（SEQ. ID. No. 1)中，我们设计了包含编码该 Stx2B蛋白的核苷酸序列的序列，该序列在序列的5 '端具有NsiI酶的位点，在序列的3 '端具 有Af 1Π 酶的位点，并具有编码15个氨基酸的接头的序列(粗体）。
[0142] 以pGEM-T载体中的以前克隆的序列为模板，通过PCR获得Stx2B基因 (Seq.ID.No.2)(Capozzo等，2003.Infect Tmmun 71:3971-3978)〇
[0143] 因此，制备以下寡核苷酸以用作PCR中的引物：
[0144] 正向引物（Seq.ID.No.18):
[0145] 5；ATCAACATGCATGCGGATTGTGCTAAAGGT 3'
[0146] 反向引物 15(Seq.ID.No.l9):
[0147] 5 ' TAAAATCTTAAGACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCGTCATTATTA AACTGCAC 3，
[0148] 如实施例2C中所述的进行PCR反应。循环模式为:94°C2分钟，1个循环;92°C10秒， 68°C12秒和72°C30秒，35个循环；以及，72°C2分钟，1个最终循环。
[0149] 使用琼脂糖凝胶对PCR产物进行检查，然后使用Qiagen提取试剂盒(Qiagen，UK)进 行纯化。
[0150] c)如实施例2(C)中所述的，用NsiI和Af III限制性酶对pETlla-BLS质粒和纯化的 基因进行消化，并在16°C用DNA T4连接酶进行连接。将连接物转化到大肠杆菌DH5a感受态 细胞中，并利用特异性引物(正向和反向15)通过PCR对菌落进行筛选。通过测序确认插入。 测序分析显示，布鲁氏菌属2，4_二氧四氢蝶啶合酶的前8个氨基酸被来自猫科动物Stx2B蛋 白的70个氨基酸（Seq. ID. No. 1)替换。由此获得了编码具有Seq. ID. No. 7的嵌合融合蛋白 (称为 BLS-Stx2B(L15))的基因。
[0151] 实施例7
[0152] 通过以下方案构建pCI-ne〇-BLS-Stx2B_L15质粒：
[0153] 将克隆在pETl Ia载体中的BLS_Stx2B(L15)的基因序列Seq. ID. No. 8亚克隆到载体 pCi-neo(Promega，USA)中。因此，制备以下寡核苷酸以用作PCR中的引物：
[0154] BLS-DNA-嵌合体alI (Seq · ID · No · 20):
[0155] 5 'GTTTAAGAATTCGAAGGAGATACCACCATGCAT 37
[0156] BLS-Back(Seq.ID.No.21)：
[0157] 37 CGTAGCGCGAACAGACTCGATCGTACTGACCACCTGT 57
[0158] 引物BLS-DNA-嵌合体all添加了用于EcoRI酶的限制性位点（粗体)和Kozak共有序 列（下划线）;BLS-Back引物添加了用于Nhe頂每的限制性位点(粗体）。
[0159] 使用pETlla-BLS-Stx2B(L15)质粒作为模板，通过PCR来扩增此类序列。如实施例3 所述的进行PCR。如实施例3所述的，将PCR产物用EcoR頂每和NheI酶进行消化，并将pCI-neo 载体用EcoRI和XbaI进行消化。然后，如实施例2 (C)中所述的实施连接反应(Nhe I和XbaI酶 具有兼容的末端）。将连接物转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，并利用特异性引物(BLS-DNA-嵌合体all/BLS-Back以及正向/反向15)通过PCR对菌落进行筛选。通过测序对获得的 构建体进行检查。在大肠杆菌DH5a细胞中对 pCI-ne〇-BLS-Stx2B(L15)质粒进行扩增，并进 一步通过"mini prep"柱(Qiagen，UK)进行纯化。DNA的纯度和浓度通过分光光度计在260/ 280nm处进行评估。
[0160] 实施例8
[0161] BLS_Stx2B(具有5个、10个和15个氨基酸的接头)嵌合体的纯化
[0162] 将三种petlla-BLS_Stx2B质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，以表达 重组蛋白。在37°C下使细胞在补充有氨苄青霉素的LB肉汤中生长并伴随振摇(250rpm)。将 过夜培养物用新鲜的LB-氨节青霉素培养基1 : 100稀释，并生长达到0D6QQrm= 1。在这个点上， 通过添加 ImM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG) (Sigma)，对培养物进行诱导，并在28°C 下伴以振摇(250rpm)孵育3h。在4°C下，将细菌以15 ,OOOg离心20min。将收获的细胞重悬于 缓冲液50mM Tris-HCKpH 8.0)中，并通过超声进行裂解。
[0163] 所有的Stx2B-BLS嵌合体均表达为包涵体（图2A)。通过在室温下在8M尿素、50mM Tr i s/HCI、5mM EDTA (pH 8)的缓冲液中伴随振摇孵育过夜，使包涵体溶解。用12-14， 000MWC0膜（Spectrum Laboratories，Inc.，Rancho Dominguez，CA，USA)将蛋白以IM尿素、 50mM Tris/HCl、5mM EDTA(pH 8.5)的缓冲液进行透析。通过在Q_Sepharose(Pharmacia，GE Healthcare Life Sciences)柱中的阴离子交换层析，使用与UV/vis检测器(GiIson，model 152)连接的HPLC装置(Gilson model 320)对溶解的蛋白进行纯化。使用处于IM尿素、50mM 1^8/!1(：1、111^?1〇^!18.5)的缓冲液中的0-謂线性梯度的似(：1进行洗脱。将蛋白用10， OOOMWC〇Centri.pre.p?浓缩系统（Millipore，Carrigtwohill，Co · Cork，Ire land)进行浓缩。 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE(15%，w/v)测定制剂的纯度（图2B和 图2D)，并通过标准方法进行定量。每次免疫之前，将蛋白以磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行透 析。如由SDS-PAGE所测定的，该蛋白具有预期的分子量（图2D);并且，通过蛋白质印迹分析， 该蛋白被抗BLS抗体和抗Stx2抗体识别（图2C)。
[0164] 实施例9
[0165] 用pCIne〇-BLS-Stx2B L5、L10和L15转染293T细胞
[0166] 为了证实BLS_Stx2B在真核细胞内的正确表达，使用P〇lyFect:?.Reagent (Qiagen Inc.)，用PCI-BLS-Stx2B转染293T细胞。简要来说，在37°C下5%⑶2中，在6孔培养板中使6 X IO5个细胞/孔生长于具有Antibiotic-Antimycotic(AA)和5%胎牛血清（FBS，Natocor) 的RPMI 1640培养基中。将2yg pCIne〇-BLS-Stx2B用RPMI培养基稀释至100μΙ，并加入20μ1 PolyFect?试剂。将混合物在室温下孵育lOmin，以允许复合体形成。将转染混合物用RMPI 培养基稀释至Iml，加入至细胞，并在37°C下5 % CO2中于具有AA和2 %FBS的RPMI 1640培养 基中孵育48L48小时后，用PBS收获细胞，并在1500rpm下离心5分钟。将细胞沉淀重悬于 SDS-PAGE样品缓冲液（用于细胞裂解）中，并进行蛋白质印迹分析。将细胞裂解蛋白产物进 行15 % SDS-PAGE，并电转移到硝酸纤维素膜上。将膜用稀释于I3BS-吐温0.1 %中的5 %牛奶 在室温下封闭2h，并在4°C下与稀释于3%牛奶、PBS-吐温0.1 %中的BLS特异性抗体（1: 2000)孵育过夜。将膜进行洗涤，并在室温下与缀合过氧化物酶的兔抗小鼠 IgG(l: 3000) (Bio-Rad Laboratories ,Hercules，CA，USA)孵育2h。将反应物用ECL溶液进行显影（图3)。
[0167] 图3显示，所有三种pCIne〇-BLS_Stx2B构建体均能够在真核细胞系293T中表达相 应的蛋白，在蛋白质印迹分析中揭示为预期分子量(约25kDa)的特定条带。
[0168] 实施例10
[0169] 通过圆二色性(circular dichroism)进行的结构分析
[0170] 为了评价纯化的嵌合体的二级结构，对远UV(200nm-250nm波长范围）中的圆二色 性(CD)信号进行测量。
[0171 ] 在JASCO J-810分光偏振计（spectropolarimeter)上，使用Imm或2mm光程的石英 比色皿，在25°C下的PBS(pH 7.0)缓冲液中，对远UV区（250nm-200nm)中的BLS-Stx2B、BLS和 Stx2B 的 CD谱进行测量。使用 ProtParamExPASy 工具（http://web.expasy.org/ pro tparam/)，利用获得的每种蛋白的理论分子量值，将数据转换为摩尔椭圆率[Θ ] (mo Iar ellipticity，以单位。cm2ymolpr〇t- 1计）。
[0172] 证明了 BLS-Stx2B的远UV-CD谱与由单独的BLS和单独的Stx2B的CD信号的结合从 理论上计算出的该蛋白的远UV-CD谱实际上相同。这些结果表明在三种嵌合体的结构中， BLS和Stx2B二者的二级结构均得以保留（图4)。
[0173] 实施例11
[0174] 通过静态光散射进行的结构分析
[0175] 在与高效液相色谱系统（包含Waters 486UV检测器和LKB 2142差示折光计）串联 连接的Precision Detectors Η)2010光散射仪上，对BLS-Stx2B的平均分子量(Mw)进行测 定。一般而言，将BLS-Stx2B L5、L10和L15(0.5-lmg/ml)各200μ1-400μ1 加载到Superdex 200HR-10/30柱上，并用具有IM尿素的50mM Tris/HC1、0.15M NaCl(pH 8)的缓冲液洗脱。在 PC计算机上记录洗脱材料的90°光散射和折射率信号，并用由Precision Detectors提供的 Discovery32软件进行分析。使用牛血清白蛋白（Mw:66.5kDa)作为标准品，对90°光散射检 测器进行校准。所得到的MW与理论MW之间的相似性表明，每种嵌合体结构的合适折叠与天 然BLS的四级结构一致(图5)。
[0176] 实施例12
[0177] 热变性分析
[0178] 在对处于PBS(pH 7.0)缓冲液中的BLS-Stx2B L5、L10和L15以及BLS野生型和 Stx2B样品热诱导变性后，在JASCO J-810分光偏振计上对这些蛋白的222nm⑶信号随温度 的变化进行测量。通过用Peltier系统(Jasco)升高温度将样品缓慢加热。温度扫描范围为 25-100°C，速度为4°C/min。每0.5°C测量222nm处的摩尔椭圆率。由此，热转变的温度中点被 视为表观熔融温度(T m)。嵌合体的适当折叠结构还得到了与单独的Stx2B模块和单独的BLS 模块比较的热稳定性分析的支持。通过CD谱对这些蛋白的热变性进行分析（图6)』LS的结 构直到85°C都是稳定的。在高于此温度时，蛋白以不可逆的过程协作解折叠 (cooperatively unfolds)，具有89°C的表观Tm。另一方面，Stx2B直到50°C都保持稳定，然 后协作且不可逆地解折叠，表观T mS60°C。
[0179] 相反，所有BLS_Stx2B嵌合体直到85°C都保持稳定，在高于此温度时，蛋白以复杂 的过程进行解折叠。嵌合体的CD信号减少，推测是由于嵌合体的十聚体结构中变性的Stx2B 结构域的聚集现象，该聚集现象扰乱BLS模块的结构，促进它们解折叠。然而，所有三种嵌合 体中显示出的在60°C时STXB的热转变丧失表明，BLS分子使志贺样B毒素的亚基得到稳定， 从而将五聚体的变性延迟到83°C。
[0180] 实施例13
[0181 ] GB3结合分析
[0182] 因为Stx2B的五聚体构型对GB3结合是必需的，将Gb3结合ELISA分析用于在功能上 确认具有5个、10个或15个氨基酸长的肽接头的嵌合蛋白形式(分别为BLS-Stx2B-L5、BLS-Stx2B-L10和BLS-Stx2B-L15)是否组装成天然全毒素 B亚基的构型。如以前所述的实施该分 析(Akenazi等，1989. J.ClinMicrobiol 27:1145-1150)。将溶于氯仿：甲醇（2:1)中的GB3 (Matreya，State College，PA)用于涂覆％孔ELISA板（Greiner Bio-One，Frickenhausen， Germany)，Iyg每孔。将来自BLS-Stx2B免疫的小鼠的血清池用作一抗（1:1000稀释），将缀合 有过氧化物酶的山羊抗小鼠 IgG (Zymed，Invitrogen，Carisbad，CA，USA)用作二抗（1:3000 稀释）。将反应物用邻苯二胺（Sigma，St 1^11&，10，1^4)显影，并读取492腦处的吸光度。将 BLS和大肠杆菌BL21提取物用作非特异性结合的阴性对照。
[0183] 关于嵌合体和重组Stx2全毒素，观测到剂量依赖性模式的阳性反应，但在BLS中并 未观测到（图7)。由这些发现可推论出，在三种嵌合蛋白形式中，BLS十聚体顶部上的B亚基 均正确组装，并且均维持了它们的Gb3结合能力。
[0184] 实施例14
[0185] 免疫期间抗体-滴度的时程
[0186] 为了评估相比单独的重组纯化的Stx2B亚基(Stx2B)而言BLS_Stx2B改善体液免疫 应答的能力，在弗氏佐剂(FA)存在的情况下用Stx2B或具有10个氨基酸长的G/S接头肽的嵌 合体(BLS-Stx2B-Ll0) i . p.注射小鼠组。在室温下，将氢氧化铝凝胶(AH)悬浮液（lmg/ml)与 Stx2B-BLS混合，并在伴随振摇的情况下孵育30分钟。将AH吸附的抗原以10，OOOg离心 IOmin，并将沉淀重悬于PBS中。
[0187] 在超过两个月的时间中，对来自免疫接种小鼠血清中的特异性IgG抗体进行分析。 在两个免疫接种组中均引发出Stx2B特异性IgG滴度（图8A) ALS-StUB-LlO组的ELISA滴度 在前三次免疫接种期间上升，并在第三次免疫接种后14天达到高峰。同时，Stx2B免疫的小 鼠在给予第三次免疫接种后45天之前没有显示出特异性抗体应答，个体之间具有高的滴度 变化。在所有分析的时间处，由BLS-Stx2B-L10产生的抗体滴度均显著高于Stx2B组的抗体 滴度(Ρ〈〇·〇〇5)(图 8A)。
[0188] 另外，为了评价在不同配方或免疫接种方案下BLS_Stx2B刺激免疫系统以及产生 抗体的能力，我们用具有弗氏佐剂(FA)或氢氧化铝(AH)的BLS-Stx2B-L10蛋白以及无任何 佐剂的BLS-Stx2B-L10蛋