乳酸菌培养基、制备叶酸的方法以及确定叶酸含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及乳酸菌培养基、制备叶酸的方法以及确 定叶酸含量的方法。更具体地，本发明涉及乳酸菌培养基、制备叶酸的方法以及确定发酵液 中叶酸含量的方法。
【背景技术】
[0002] 叶酸由蝶啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸组成，也叫蝶酰谷氨酸，它是B族维生素的 一种。人体内无法自主合成叶酸，几乎完全依赖于体外摄入，当摄入量不足或利用率降低 时，体内便会出现叶酸缺乏的症状。天然叶酸广泛存在于动植物类食品中，但由于天然的叶 酸极不稳定，易受阳光、加热的影响而发生氧化，所以人体真正能从食物中获得的叶酸并不 多。乳酸菌能够通过代谢形成大量的叶酸，是合成叶酸较好的选择。
[0003] 然而，目前乳酸菌培养基及制备叶酸的方法仍有待改进。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提供一种乳酸菌培养基、一种制备叶酸的方法以及一种确定发酵液中叶酸含量的方 法。利用该乳酸菌培养基得到的叶酸、利用该制备叶酸的方法得到的叶酸以及利用确定发 酵液中叶酸含量的方法确定的叶酸含量高、安全性高、吸收效果好或者无毒副作用。
[0005] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0006] 论文《产叶酸菌株的筛选、生物学特性研究和发酵条件优化》中提出了一种制备叶 酸的培养基，但是菌株利用该培养基进行发酵的时间较长，并且得到的叶酸含量较低。
[0007] 本发明的发明人经过大量实验发现，通过对乳酸菌的种子培养基和乳酸菌培养基 的组成成分以及发酵条件进行优化，并利用色谱法确定叶酸的含量，得到较高含量的叶酸。 由此，利用该乳酸菌培养基、利用该制备叶酸的方法得到的叶酸以及利用确定发酵液中叶 酸含量的方法确定的叶酸具有下列优点的至少之一：含量高、安全性高、吸收效果好以及无 毒副作用。
[0008] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种乳酸菌培养基。根据本发明的实施例， 基于1升的所述乳酸菌培养基，所述乳酸菌培养基包括：5~15g的蛋白胨；5~15g的牛 肉浸膏；2~10g的酵母膏；10~30g的葡萄糖；1~5g的K2HP04 ;2~10g的CH3C00Na ; 0? 5~2g的Tween-80 ;1~5g的柠檬酸二胺；0? 2~lg的MgS04 ? 7H20 ;0? 1~0? 5g的 MnS04 *4H20 ;100~1000g的对氨基苯甲酸；1~5g谷氨酸；以及余量的去离子水，根据本 发明的具体示例，所述乳酸菌培养基的pH值为5. 5~7. 5,根据本发明的另一个具体示例， 所述培养基作为用于制备叶酸的发酵培养基，根据本发明的优选示例，所述乳酸菌为保加 利亚乳杆菌。由此，利用根据本发明实施例的乳酸菌培养基得到的叶酸具有下列优点的至 少之一：含量高、安全性高、吸收效果好以及无毒副作用。
[0009] 在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备叶酸的方法。根据本发明的实施例， 该制备叶酸的方法包括：利用前面描述的乳酸菌培养基，对乳酸菌进行发酵培养，以便获得 含有叶酸的发酵液。由此，根据本发明实施例的制备叶酸的方法得到的叶酸具有下列优点 的至少之一：含量高、安全性高、吸收效果好以及无毒副作用。
[0010] 根据本发明的实施例，上述制备叶酸的方法还可以具有下列附加技术特征至少之
[0011] 根据本发明的实施例，在进行所述发酵培养之前，预先利用种子培养基对所述乳 酸菌进行活化培养，以便得到种子液，基于1升的所述种子培养基，所述种子培养基包括： 5~15g的蛋白胨；5~15g的牛肉浸膏；2~10g的酵母膏；10~30g的葡萄糖；1~5g 的K2HP04;2 ~10g的CH3C00Na;0? 5 ~2g的Tween-80 ;1 ~5g的柠檬酸二胺；0? 2 ~lg的 MgS04 ? 7H20 ;0. 1~0. 5g的MnS04 ? 4H20 ;以及余量的去离子水。由此，根据本发明实施例 的制备叶酸的方法得到的叶酸可以进一步具有较高的含量、较高的安全性、较好的吸收效 果或者无毒副作用。
[0012] 根据本发明的实施例，所述乳酸菌按照1~5%的接种量接入所述种子培养基中， 所述种子液按照1~5%的接种量接入所述乳酸菌培养基中。由此，根据本发明实施例的制 备叶酸的方法得到的叶酸可以进一步具有较高的含量、较高的安全性、较好的吸收效果或 者无毒副作用。
[0013] 根据本发明的实施例，所述活化培养是在42摄氏度的温度下进行24小时，所述活 化培养次数为3次；所述发酵培养是在30~45摄氏度的温度以及5. 5~7. 5的pH值下培 养5. 5~7. 5小时。由此，根据本发明实施例的制备叶酸的方法得到的叶酸可以进一步具 有较高的含量、较高的安全性、较好的吸收效果或者无毒副作用。
[0014] 本领域技术人员能够理解的是，前面针对乳酸菌培养基所描述的特征和优点同样 适用于该制备叶酸的方法，在此不再赘述。
[0015] 在本发明的第三方面，本发明提出一种确定发酵液中叶酸含量的方法。根据本发 明的实施例，所述发酵液是根据前面描述的方法获得的，所述确定发酵液中叶酸含量的方 法包括：（1)将所述发酵液在8000~12000r/min的转速下离心10分钟，取上清液，然后采 用滤膜进行过滤，以便得到待测样品；（2)通过液相色谱法对所述待测样品进行检测，所述 液相色谱法检测是按照下列条件进行的：色谱柱：Agilent )(DB-C18柱；紫外可见吸收检测 器：可见光检测器，其中紫外检测波长为254nm ;流动相：甲醇；柱温：25摄氏度；流速：lmL/ min ;进样量：20微升；保留时间：20分钟，其中，所述甲醇预先与水按照10:90的体积比进 行混合，并用Na2HPOJP NaH 2P04调节pH值至7. 6,经过滤膜过滤，并进行超声脱气15分钟。 由此，根据本发明实施例的利用确定发酵液中叶酸含量的方法确定的叶酸具有下列优点的 至少之一：含量高、安全性高、吸收效果好以及无毒副作用。
[0016] 本领域技术人员能够理解的是，前面针对制备叶酸的方法所描述的特征和优点同 样适用于该确定发酵液中叶酸含量的方法，在此不再赘述。
[0017] 在本发明的第四方面，本发明提出了另一种乳酸菌培养基。根据本发明的实施例， 基于1升所述乳酸菌培养基，所述乳酸菌培养基包括：l〇g的蛋白胨；l〇g的牛肉浸膏；5g的 酵母膏；20g的葡萄糖；28的1(2即04加的CH3C00Na ;lg的Tween-80 ;2g的柠檬酸二胺；0. 5g 的MgS04 *7H20 ;0. 3g的MnS04 *4H20 ;400g的对氨基苯甲酸；以及4g的谷氨酸，根据本发明 的具体示例，所述乳酸菌培养基的pH值为7,根据本发明的优选示例，所述乳酸菌为保加利 亚乳杆菌。发明人发现，培养基成分及含量对乳酸菌产叶酸的含量至关重要，发明人经过大 量实验筛选及优化得到最优培养基成分及其含量，乳酸菌利用该最优培养基产生的叶酸含 量最高。由此，根据本发明实施例的利用乳酸菌培养基得到的叶酸具有下列优点的至少之 一：含量高、安全性高、吸收效果好以及无毒副作用。
[0018] 在本发明的第五方面，本发明提出了另一种制备叶酸及确定叶酸含量的方法。根 据本发明的实施例，该方法包括：（1)制备种子培养基：称取蛋白胨log、牛肉浸膏log、酵母 膏 5g、葡萄糖 20g、K2HP042g、CH3C00Na 5g、Tween-801g、柠檬酸二胺 2g、MgS04 ? 7H20 0? 5g、 MnS04*4H20 0. 3g，调节pH值至7,用去离子水定容至1L;121摄氏度下灭菌15分钟；（2)制 备乳酸菌培养基：称取蛋白胨l〇g、牛肉浸膏l〇g、酵母膏5g、葡萄糖20g、K 2HP042g、CH3C00Na 5g、Tween-80 lg、柠檬酸二胺 2g、MgS04.7H20 0.5g、MnS04.4H20 0.3g、对氨基苯甲酸 400g、 谷氨酸4g，调节pH值至7,用去离子水定容至1L ; 121摄氏度下灭菌15分钟；（3)将乳酸菌 能以3%的接种量接种于所述种子培养基中，42摄氏度活化培养24h，连续活化3代，以便 得到种子液；(4)将所述种子液以3%的接种量接种于所述乳酸菌培养基中，42摄氏度培养 6h，以便得到含有叶酸的发酵液；（5)将所述含有叶酸的发酵液在lOOOOr/min的转速下离 心lOmin，取上清液，然后采用孔径为0. 45 y m的滤膜进行过滤，以便得到待测样品；(6)通 过高效液相色谱法检测待测样品中叶酸含量，色谱条件为：色谱柱：Agilent )(DB-C18柱； 紫外可见吸收检测器：可见光检测器，其中紫外检测波长为254nm ;流动相：甲醇；柱温：25 摄氏度；流速：lmL/min ;进样量：20微升；保留时间：20分钟，其中，所述甲醇预先与水按照 10:90的体积比进行混合，并用Na2HP04和NaH2P04调节pH值至7. 6,经过滤膜过滤，并进 行超声脱气15分钟。由此，利用根据本发明实施例的制备叶酸及确定叶酸含量的方法得到 的叶酸具有下列优点的至少之一：含量高、安全性高、吸收效果好以及无毒副作用。