鸭支原体培养基及鸭支原体的分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细菌培养基及分离纯化的方法，具体涉及鸭支原体培养基及鸭支原体的分离纯化方法。
【背景技术】
[0002]鸭支原体(Mycoplasmaanatis)主要引起鸭的传染性窦炎，临床上易感染雏鸭，导致眶下窦、鼻腔、气管及气囊的炎症，其中眶下窦肿胀最为典型。当鸭支原体与其他病原(如流感病毒、大肠细菌)混合感染时，可引起鸭呼吸困难、软脚、腹泻、共济失调、斜颈、转圈或倒退运动等一系列神经系统症状，严重影响鸭的生长和发育；组织学病变表现为淋巴细胞性脑膜炎、纤维蛋白渗出性的气囊炎、间质性肺炎和淋巴滤泡性气管炎(Stipkovits，
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[0003]1964年Robert首次报道从患有窦炎的小鸭中分离出鸭支原体，之后西班牙、美国等国家相继分离到鸭支原体，karpas、Amin等从北京鸭、短颈小野鸭和斑背浅鸭中分离出鸭支原体(Ivanics et al，1988;Poveda et al，1990;Goldberg et al，1995)。我国是世界上主要的鸭养殖基地，鸭肉产量占全球总量的66%;国内学者于1989年和1991年就证实了鸭支原体在我国的存在，而近两年国内有关鸭支原体合并病毒、细菌感染的病例屡见不鲜，给养鸭业造成了重大危害和经济损失，表明鸭支原体感染在我国持续时间已经很久。
[0004]鸭支原体是一类特殊的微生物，无细胞壁，由于其基因组较小，造成基因组中编码氨基酸和辅助因子合成的基因就少，导致支原体生物合成和代谢的能力相当有限；由于支原体属于氨基酸、脂类和某些辅助因子营养缺陷型，很难对环境变化做出调整，仅在特定的环境下生存，因此鸭支原体对体外培养基的选择相当苛刻，需要从中摄取脂肪酸、胆固醇、核酸前体和能量来源等营养成分促进自身繁殖。鸭支原体(Mycoplasma anatis)不同于其他禽类支原体，如鸡毒支原体(Mycoplasma gal lispeticum)、滑液支原体(Mycoplasmasymoviae)、泄殖腔支原体(Mycoplasma cloaclae)、莱氏无胆甾支原体(Acolaplasmalaidlawii)等感染多种宿主，鸭支原体只寄生于鸭体内。关于鸭支原体的诊断，主要为聚合酶链反应(PCR)和直接免疫荧光实验(FA)，二者均涉及支原体纯培养物即单个菌落的分离和培养;而目前分离鸭支原体使用的人工培养基一般均由Frey或PPL0培养基改良而来，仍存在活菌滴度低、繁殖能力差等问题，易产生漏诊；因此，本领域亟需高效稳定、快速分离诊断鸭支原体的培养基以及分离纯化鸭支原体的方法，进而开展鸭支原体感染的治疗与防控研究。
【发明内容】
[0005]本发明提供了鸭支原体培养基，该培养基能够用来分离纯化鸭支原体，活菌滴度高，繁殖能力强;本发明还提供应用该培养基分离纯化鸭支原体的方法。
[0006]本发明为解决以上技术问题所采用的方案为:
鸭支原体培养基，包括液体培养基和固体培养基，所述液体培养基由以下组分组成:去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，1%的酚红，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基，灭活的马血清，酵母浸出液，青霉素，L-半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
所述固体培养基由以下组分组成:去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，琼脂粉，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基，灭活的马血清，酵母浸出液，青霉素，L-半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
[0007]作为优选，所述液体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.5-6mL/L，PPLO肉汤3-5g/L，葡萄糖4-6g/L，蛋白胨4-6g/L，胰蛋白胨8_10g/L，1%的酚红2_3mL/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450-500mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母浸出液45-55mL/L，青霉素200-300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L，余量为去尚子水。
[0008]最优选地，所述液体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.8mL/L，PPL0肉汤3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，1%的酚红2mL/L，含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L，灭活的马血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L，余量为去离子水。
[0009]作为优选，所述固体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.5-6mL/L，PPLO肉汤3-5g/L，葡萄糖4-6g/L，蛋白胨4-6g/L，胰蛋白胨8_10g/L，琼脂粉10_12g/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450-500 mL/L，灭活的马血清150_180mL/L，酵母浸出液45_55mL/L，青霉素200-300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-
0.2g/L，余量为去呙子水。
[0010]最优选地，所述固体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.8mL/L，PPLO肉汤3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂粉12g/L，含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L，灭活的马血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L，余量为去离子水。
[0011]作为优选，所述酵母浸出液的制备方法为:将酵母溶于5倍去离子水中，在30°C下磁力搅拌1小时；10-15分钟内逐渐增加温度到40°C ；之后每分钟增加5°C至沸点，煮沸3-5分钟，冷却至室温，离心，取上清，依次经0.8 μηι、0.45 μηι、0.22 μπι的滤器过滤后收集滤液即得。
[0012]采用上述方法制备得到的酵母浸出液具备以下优点:不断搅拌可使酵母的溶解性增加，浸出液色泽为淡黄色至黄色;缓慢升高温度可减少浸出液营养成份的破坏;整个制备过程的总时间控制在2小时左右，减少了污染杂菌的概率。
[0013]作为优选，除添加琼脂粉，去掉酚红指示剂外，所述固体培养基其余组分和各组分含量均与液体培养基相同。通常情况之下，固体培养基与液体培养基成分应该保持一致的，这样能够确保支原体生长状态的稳定；另外在大批量配置液体及固体培养基时可同时进行，节省人力和时间。
[0014]本发明还提供上述培养基的制备方法，所述液体培养基的制备方法为:将配方量的去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPL0肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，1%的酚红充分混匀，调pH值为7.8，121°C高压灭菌15分钟，冷却至50-55°C，加入配方量的无菌的CMRL-1066培养基(含L-谷氨酰胺)，灭活的马血清，酵母浸出液，无菌的青霉素水溶液，无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液以及无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液，添加时无先后顺序，最后微调pH值至 7.7-7.8。
[0015]作为优选，所述固体培养基的制备方法为:将配方量的去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPL0肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，琼脂粉充分混匀，调pH值为7.8,121°C高压灭菌15分钟，放入50-55°C的水浴锅中冷却，加入配方量的无菌的CMRL-1066培养基(含L-谷氨酰胺)，灭活的马血清，酵母浸出液，无菌的青霉素水溶液，无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液以及无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液，添加时无先后顺序，混匀后倒平板，得固体培养基。
[0016]本发明的第三个目的是提供鸭支原体分离纯化的方法，包括以下步骤:
1.用无菌棉签在鸭的鼻后孔、气管、泄殖腔或气囊采样、或挑取大约0.lmL的卵黄液(含部分卵黄膜)、或无菌条件下剪切小块病样组织接种到4.5mL的液体培养基中(棉签需弃掉)，置于37°C、5% C02培养箱中培养，24小时后，进行第一代盲传，无论液体培养基颜色是否改变，将上述液体培养物划线接种到固体培养基进行菌落生长;若此时，上述液体培养基pH下降，颜色由红色变为黄色，可按1:10的比例转接到新的液体培养基中传代增殖;若未发生pH值下降，继续放置培养箱中培养，待颜色变黄立即转接新的液体培养基和固体培养基。
[0017]2.上述固体培养基培养5-7天，低倍镜下观察菌落的生长情况，用接种环无菌刮取平板上的菌落接种到新的液体培养基中培养生长，再将变黄的培养物接种到固体培养基上;重复该步骤，确保分离到支原体特征菌落。
[0018]步骤1和2表明，由于初步分离支原体时，病料本身和其他杂菌污染可能会抑制鸭支原体的生长，影响支原体的分离，因此，在首次接种液体培养基24小时后，无论液体培养基是否发生颜色改变，需在固体培养基中进行盲传；同时，根据液体培养基颜色的变化，考虑是否转接新液体培养基进行增殖。若24小时内液体培养基未发生颜色的改变，需继续放置在培养箱中培养，每日观察，待pH下降、液体变黄时转接新的液体培养基和固体培养基进行增殖和分离。由于病料的来源、类型不同，支原体在分离初期生长的速度也不尽相同，因此需多次重复步骤2，确保分离到支原体特征性菌落。