烟草内生真菌菌株ycef053的固态发酵培养基及其培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵领域，提供了一种用于内生真菌发酵培养，尤其是固体发 酵培养的培养基及其培养方法。
【背景技术】
[0002] 固体发酵（solid-statefermentation，SSF)是在指没有或几乎没有自由水存在 下，在有一定湿度固态基质中，用一种或多种微生物进行的一个生物反应过程（Singhania etal.，2009)。从生物反应过程的角度考虑，固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程， 更为具体的，我们可以认为固体发酵是一种在培养基为固体微粒的情况下进行利用的一 种发酵手段（Mitchelletal.，2000b)。固体发酵与液体发酵相比有许多显著的优点：培 养基更为便宜、低能耗、投入成本低、更容易控制发酵体积、产生的废水较少（PandeyAet al.，2000;PandeyAetal.，2008)。以培养基的用料为例，用于固体发酵的培养基比较单 纯，一般来说，例如谷物类、小麦麸、小麦草、大宗谷物或农产品等均可被使用，所以发酵原 料成本较经济。
[0003] 对于大多数的微生物而言，其生长的环境并没有大量的自由水存在。即便是海 洋中的微生物，其中有超过98%的种类是生长于水下表层的固体介质中的，对于真菌而 言，所有已知的真菌中只有不到1%的种类是在海洋中发现的（Carlile&Watkinson, 1994 ; Kelecom，2002)。也正是因为如此，固体发酵能够较好地模拟真菌的生长环境，从而适用于 真菌的生物发酵。
[0004] 到目前为止，有许多人研究了影响固体发酵进程的生物化学和工程学的因 素（Mitchelletal.，2000a, 2000b;Pandey, 2003)，但是SSF中的许多技术问题仍然 没有得到解决（H51:keretal.，2004)。即便如此，SSF在生物技术中的运用已经很 广泛了（Raimbault, 1998;Pandeyetal.，2000, 2001)。在许多综述中可以查到运用 SSF技术生产的一些生物产品或代谢物，如次级代谢产物（Balakrishnan&Pandey，1996 ; Robinsonetal.，2001)、黄曲霉素（Barrios-Gonzalez&Tomasini, 1996)、工程酶（Pandey etal.，1999)、细菌酶（Babu&Satyanarayana, 1996)、淀粉糖化酶（Selvakumaret al.，1998)、纤维素酶（Cen&Xia，1999)、中国食品（Hanetal.，2001)、木质素的生物转 化（Tengerdy&Szakacs，2003)、食用菌种植和天然香料的生产（Wang, 1999)、富蛋白食物 (Nigam&Singh，1996)等。
[0005] 关于固体发酵工艺的优化，一般情况下，都会从温度、培养基、初始pH、含水量、接 种量、种龄、发酵时间等角度考虑，而关于培养基，更是涉及了碳源、氮源和无机盐的选择 (DavoodMazaherietal. , 2012；TamiresCarvalhodosSantosetal. , 2012；Madhuri Narraetal. , 2012;FatmaChaarietal. , 2012)。以含水量为例，在蛋白酶和脂肪酶的生 产中，高含水量会降低培养基质的多孔性，从而妨碍气体的交换，而低含水量则会减少微生 物的生长，从而使酶的产量下降（Mahantaetal.，2008)。再以发酵时间（发酵进程）对固 体发酵的影响为例，Biazus等人在采用玉米麦芽糖进行研究的时候发现，发酵开始时，产物 的量很低，而随后产物的量就迅速上升直到达到最大值，在达到最大产物量后，产物的生成 就受到了抑制，并且产物的活性也会下降（Biazusetal.，2006)。
[0006] 人工神经网络（ArtificialNeuralNetwork，ANN)简称神经网络，是在人类对其 大脑神经网络认识的基础上人工构造的能够实现某种功能的信息处理系统，具有非线性、 非局限性、非常定性等优点。目前神经网络的种类有60多种，如BP(Back-propagation)神 经网络、RBF(RadicalBasisFunction)神经网络、SVM(SupportVectorMachine)神经网 络、S0M(Self_0rganizingFeatureMap)神经网络等。人工神经网络技术具有很强的非线 性映射，它根据输入输出数据来建立模型，网络的统计信息储存在连接权矩阵内，故可以反 映十分复杂的非线性关系，网络的输出端点个数不限，因而很适合于多因变量、多自变量统 计中的建模，在发酵工业中广泛应用，如，培养基优化、发酵建模过程和控制优化以及发酵 分批补料控制等。
[0009]t 输入输出间的突触时延
[0010] Tj一神经元j的阀值
[0011]wij-神经元i到j的突触连接系数/权重值
[0012] f(x)-神经元变换函数
[0013] 神经网络有许多优良的性能，如：非线性映射能力、自组织性和自适应性能力、记 忆联想能力等。神经网络的模型很多，目前应用最广泛的具有成效的是BP(误差反向传播 算法，BackPropagation)神经网络模型，除此之外，还有RBF(径向基函数，RadicalBasis Function)神经网络、SVM(支持向量机，SupportVectorMachine)也有应用。
[0014] 遗传算法（Geneticalgorithms，GA)由Michigan大学Holland教授于 2〇 世纪 70年代提出。GA采用选择（Selection)、交叉（Crossover)和变异（Mutation)运算来实现 "物竞天择，适者生存"这一自然法则的模拟.将神经网络和遗传算法耦联处理，可以较好地 优化出培养基配方。
[0015] 遗传算法的第一步是将实际问题的参数集编码成位串，通常采用二进制编码或者 实数编码。本实验优化中采用实数编码。第二步，从编码的数据中随机产生初始种群1，进 入第一轮筛选。第三步，对初始种群进行适应值计算。第四步，进行选择与遗传操作。第五 步，统计经第四步产生的个体，从而构成种群2。种群2将重复上述步骤产生种群3。如此 循环往复直到找到拥有最大适应值的个体，即找到最优解。
[0016] 神经网络有很强的输入输出非线性映射能力，特别适用于微生物发酵这种高度非 线性、非结构化的复杂模型中。而遗传算法又是一种有导向的全局随机搜索方法，它对于目 标函数和搜索空间没有任何限制，因此非常适合神经网络模型等无明确分析函数形式的优 化问题。
[0017] 神经网络与遗传算法之间是通过适应度函数进行耦合的。在微生物培养基优化中 通常是先通过神经网络建立培养基各组份间的数学模型，然后将这数学模型作为遗传算法 中的适应度函数求解该函数的最优解。近几年国内外许多学者应用此法成功优化了各种微 生物产品的培养基，其优化效果优于响应面、正交设计、均匀设计等。
【发明内容】
[0018] 本发明的一个目的是提供一种内生真菌YCEF053固体发酵培养基，采用该培养基 能够快速有效地得到烟草内生真菌固体发酵的产物。本发明的第二个目的是提供采用上述 的固体发酵培养基的培养方法。
[0019] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
[0020] -种内生真菌YCEF053固体发酵培养基，该固体发酵培养基包括基质和外加营养 组分以及水，其中基质按质量百分比包括50 %麸皮、10 %豆饼粉、20 %米糠和20 %玉米碎 粒；水的含量为基质总质量的50%;以基质总质量为lkg计，所述的外加营养组分包括蔗糖 13. 37g/kg;硝酸钠 3. 85g/kg;蛋白胨 14. 02g/kg;磷酸二氢钾 1. 23g/kg;硫酸|丐 10. 89g/ kg;硫酸镁 0. 52g/kg。
[0021] 为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
[0022] -种内生真菌YCER)53的培养方法，该方法包括以下的步骤：
[0023] 1)菌株活化：用灭菌的牙签挑取PDA斜面保存管中的少许菌丝，接种于PDA培养 基上，封口后置于恒温培养箱中，24h黑暗25°C下活化培养；
[0024] 2) 一级种子液培养：将10块直径5mm的菌饼，接种于在200ml液体种子培养基中， 于150r/min，25°C培养72h;液体种子培养基为指马铃薯葡萄糖培养液；
[0025] 3)二级种子液培养：200ml-级种子液用搅拌器打碎并摇晃混勾，吸取20ml接种 于200ml液体种子培养基，于150r/min，25°C培养72h;
[0026] 4)固态培养：200ml二级种子培养液打碎并摇晃混匀，吸取2ml接种于10g上述的 内生真菌YCEF053固体发酵培养基中，于25°C条件下黑暗培养7d。
[0027] 作为优选，所述的PDA培养基的制备方法如下：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂 20g，蒸馏水定容至lOOOmL;1. 1个大气压、121°C下灭菌20min。
[0028] 本发明具有如下优点：
[0029] 1、首次尝试烟草内生真菌的固体发酵，开创先例；
[0030] 2、首次得到YCER)05和YCER)53类型烟草内生真菌的人工神经网络模型；
[0031] 3、能够快速有效地得到烟草内生真菌固体发酵的产物。
【附图说明】
[0032] 图1 :菌丝中核酸量与菌丝量的关系：两个烟草内生真菌菌株菌丝中的核酸量与 菌丝干重之间具有良好的线性关系，菌株YCEF005线性方程为y= 10. 131x+0. 0332,R2 = 0? 9995 ;菌株YCER)53 线性方程为y= 11. 757x+0. 0716,R2= 0? 9988。
[0033] 图2 :不同固态基质上内生真菌的生长。
[0034] 图3 :YCER)05正交试验极差分析。
[0035] 图4 :YCER)53正交试验极差分析。
[0036]图5 :内生真菌在不同营养组分培养基上的生长。
[0037]图6 :YCER)05固态发酵人工神经网络样本。
[0038] 图7 :YCER)053固态发酵人工神经网络样本。
[0039] 图8 :三层BP人工神经网络拓扑网络计算。
[0040] 图9 :BP算法流程图（韩力群，2006)。
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