从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法及其应用；所述方法包括如下步骤：步骤一、调整楸树内生真菌发酵液pH为4～10；步骤二、预冷pH调整后的楸树内生真菌发酵液至预冷温度为0～4℃；步骤三、在保持晶核存在的情况下对步骤二所述楸树内生真菌发酵液进行缓慢降温至结冰；步骤四、继续缓慢降温结冰，直至剩余液态发酵液的体积缩至设定值，停止降温，收集未结冰的液体部分，即得楸灵素浓缩液。本发明将楸树内生真菌发酵液浓缩到原体积的十分之一以下，同时保证90％以上的楸灵素收率。与现有技术相比，本发明不仅可以更有效的保证原料中楸灵素的稳定、确保较高的浓缩收率，而且不添加任何有机溶剂，保证浓缩液质量。
【专利说明】从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]内生真菌是指那些生活在于植物组织内部并不会使植物产生明显病害的真菌。内生真菌可以产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质，具有巨大的潜在价值，可以成为新型抗癌药物的来源。本课题组已从胡桃楸里分离提取了一株具有很强抗癌活力的内生真菌(CCTCC M 208102)，初步鉴定该菌为半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，木霉菌属，其发酵提取液对肝癌细胞有很强的抑制作用。这是一个本实验室独有的全新菌种，其具有抗癌能力的发酵液制备方法已经获得专利保护(ZL200810041214.8)。由于发酵液中生物活性成分楸灵素的浓度较低，需要浓缩后才能进行有效的后期精细分离。但楸灵素对温度敏感，旋转蒸发等操作造成楸灵素大量降解，反相吸附又由于楸灵素不能有效洗脱而造成浓缩收率底下。
[0003]针对上述技术问题，本发明开发了一种对楸树内生真菌发酵液的高效浓缩方法，在保证楸灵素收率的情况下降发酵液浓缩10倍以上，能大幅度改善后续的楸灵素精细分离过程，是高效分离纯化楸灵素的基础和关键技术。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法及其应用，是一种利用结冰从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法，该方法不仅可以实现楸灵素的浓缩分离，也可用于其他物质溶液的浓缩分离。
[0005]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0006]本发明涉及一种从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法，所述方法包括以下步骤:
[0007]步骤一、调整楸树内生真菌发酵液pH为4?10 ;
[0008]步骤二、预冷pH调整后的楸树内生真菌发酵液至预冷温度为O?4°C ;
[0009]步骤三、在保持晶核存在的情况下对步骤二所述楸树内生真菌发酵液进行缓慢降温至结冰；
[0010]步骤四、继续缓慢降温结冰，直至未结冰发酵液体积与发酵液总体积比为设定值；停止降温，收集未结冰的发酵液，即得楸灵素浓缩液。
[0011]优选地，所述楸树内生真菌发酵液按照专利ZL200810041214.8所述方法制备。
[0012]优选地，步骤一中，所述楸树内生真菌发酵液的pH为8?10。
[0013]优选地，步骤二中，所述楸树内生真菌发酵液的预冷温度为1°C。
[0014]优选地，步骤三中，所述缓慢降温中的传热温差不大于6°C ；
[0015]更优选地，所述缓慢降温中的传热温差为2?6°C。
[0016]优选地，步骤四中，所述缓慢降温中的传热温差不大于4°C ；
[0017]更优选地，所述缓慢降温中的传热温差为1?4°C。
[0018]优选地，步骤三、四中，所述缓慢降温的方式包括持续加入晶核。
[0019]更优选地,所述晶核包括0 °C碎冰。
[0020]优选地，步骤三、四中，所述缓慢降温的操作具体为:每次加入1毫升0°C的碎冰，当碎冰完全融化后再次加入1毫升o°c的碎冰。
[0021]步骤四中，所述设定值可根据技术人员实际需求而定；具体为:技术人员可根据实验需求，控制发酵液结冰量，从而获得一定体积的未结冰发酵液的体积。
[0022]第二方面，本发明涉及一种从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法的应用，所述应用具体为，用于溶液中溶质的浓缩、分离。
[0023]优选地，所述溶液的溶剂包括水。
[0024]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:
[0025](1)本发明所述方法浓缩比较大，可实现发酵液10倍以上浓缩，并且所需时间短，无需持续加热，操作过程安全；
[0026](2)所有操作都在低温下操作，保证了楸灵素的稳定；
[0027](3)本发明所述方法收率高，活性成分楸灵素的收率可以达到90%以上；
[0028](4)本发明采用物理方法，通过天然结冰机制完成，整个操作过程中不使用任何有机溶剂，有效防止有机溶剂污染，保留发酵液原有成分，保证楸灵素纯度，并对操作人员无毒害。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0030]下述实施例中楸树内生真菌发酵液的制备包括如下步骤:
[0031]一、内生真菌的分离:分裂内生真菌并且采用菌丝尖端切割法进行纯化；
[0032]二、诱导孢子产生:将长枝木霉CCTCC Μ 208102接种到PDA培养基上，将长有菌丝的PDA培养基切下一块，放于CMX培养基上，室温下培养，1到3天后有孢子长出；
[0033]三、液体发酵培养:挑取孢子转接到装有PDA液体培养基中，26?28°C，180rpm摇床震荡培养，1?8天后终止发酵，即得。
[0034]实施例1
[0035]本实施例涉及一种楸树内生真菌发酵液浓缩分离楸灵素的方法，包括如下步骤:
[0036](1)调整发酵液pH为4 ;
[0037](2)发酵液预冷到1°C ；
[0038](3)设定发酵液和冷阱之间的传热温差为4°C冷冻发酵液，每次加入1毫升0°C的碎冰，当碎冰完全融化后再次加入1毫升o°c的碎冰，直到发酵液开始结冰为止；
[0039](4)设定发酵液和冷阱之间的传热温差为2°C继续冷冻发酵液，直到液态发酵液体积缩小为原来的十分之一，实现10倍浓缩，停止冷冻。
[0040]去除冰块，收集发酵液，发现发酵液颜色加深，采用HPLC方法测定发酵液中楸灵素浓度，计算楸灵素含收率为90% ；
[0041]本实施例方法在90%收率情况下实现了楸树内生真菌发酵液10倍浓缩。
[0042]实施例2
[0043]本实施例涉及一种楸树内生真菌发酵液浓缩分离楸灵素的方法，包括如下步骤:
[0044](I)调整发酵液pH为8 ;
[0045](2)发酵液预冷到4°C ；
[0046](3)设定发酵液和冷阱之间的传热温差为6°C冷冻发酵液，每次加入I毫升0°C的碎冰，当碎冰完全融化后再次加入I毫升0°C的碎冰，直到发酵液开始结冰为止。
[0047](4)设定发酵液和冷阱之间的传热温差为4°C继续冷冻发酵液，直到液态发酵液体积缩小为原来的十五分之一，实现15倍浓缩，停止冷冻。
[0048]去除冰块，收集发酵液，发现发酵液颜色加深，采用HPLC方法测定发酵液中楸灵素浓度，计算楸灵素含收率为93% ；
[0049]本实施例方法在93%收率情况下实现了楸树内生真菌发酵液15倍浓缩。
[0050]实施例3
[0051]本实施例涉及一种楸树内生真菌发酵液浓缩分离方法，包括如下步骤:
[0052](I)调整发酵液pH为10 ;
[0053](2)发酵液预冷到1°C ；
[0054](3)设定发酵液和冷阱之间的传热温差为2°C冷冻发酵液，每次加入I毫升0°C的碎冰，当碎冰完全融化后再次加入I毫升o°c的碎冰，直到发酵液开始结冰为止。
[0055](4)设定发酵液和冷阱之间的传热温差为1°C继续冷冻发酵液，直到液态发酵液体积缩小为原来的十五分之一，实现15倍浓缩，停止冷冻。
[0056]去除冰块，收集发酵液，发现发酵液颜色加深，采用HPLC方法测定发酵液中楸灵素浓度，计算楸灵素含收率为96% ；
[0057]本实施例方法在96%收率情况下实现了楸树内生真菌发酵液15倍浓缩。
[0058]实施例4
[0059]本实施例涉及一种楸树内生真菌发酵液浓缩分离方法，包括如下步骤:
[0060](I)调整发酵液pH为8 ;
[0061](2)发酵液预冷到1°C ；
[0062](3)设定发酵液和冷阱之间的传热温差为2°C冷冻发酵液，每次加入I毫升0°C的碎冰，当碎冰完全融化后再次加入I毫升o°c的碎冰，直到发酵液开始结冰为止。
[0063](4)设定发酵液和冷阱之间的传热温差为1°C继续冷冻发酵液，直到液态发酵液体积缩小为原来的二十分之一，实现20倍浓缩，停止冷冻。
[0064]去除冰块，收集发酵液，发现发酵液颜色加深，采用HPLC方法测定发酵液中楸灵素浓度，计算楸灵素含收率为96% ；
[0065]本实施例方法在96%收率情况下实现了楸树内生真菌发酵液20倍浓缩。
[0066]实施例5
[0067]本实施例涉及一种楸树内生真菌发酵液浓缩分离方法，技术方案与实施例4相同，不同之处在于，步骤(2)中预冷温度为0°C。采用HPLC方法测定发酵液中楸灵素浓度，计算楸灵素含收率为92%。
[0068]对比例1
[0069]本对比例是实施例4的对比例，技术方案与实施例4相同，不同之处在于参数设置，即在步骤(1)中，发酵液的pH为3;采用HPLC方法测定发酵液中楸灵素浓度，计算楸灵素含收率为62%。
[0070]对比例2
[0071]本对比例是实施例4的对比例，技术方案与实施例4相同，不同之处在于参数设置，即在步骤(1)中，发酵液的pH为11 ;采用HPLC方法测定发酵液中楸灵素浓度，计算楸灵素含收率为80%。
[0072]对比例3
[0073]本对比例是实施例4的对比例，技术方案与实施例4相同，不同之处在于参数设置，即在步骤(2)中，发酵液的预冷温度为_1°C;采用HPLC方法测定发酵液中楸灵素浓度，计算楸灵素含收率为64%。
[0074]对比例4
[0075]在60°C和0.07大气压真空条件下旋转蒸发浓缩1升的内生真菌发酵液到100毫升，发现发酵液颜色加深，采用HPLC方法测定发酵液中楸灵素浓度，计算楸灵素含收率为36% ;本对比例在36%收率情况下实现了楸树内生真菌发酵液10倍浓缩。
[0076]综上所述，本发明所述通过冷冻结冰过程浓缩分离楸树内生真菌发酵液的方法可以实现10倍以上的浓缩比，同时保证90%以上的活性成分楸灵素含量。克服了较高温度的旋转蒸发浓缩内生真菌发酵液时发生的或形成成分楸灵素降解和收率下降问题，可以实现楸树内生真菌发酵液中楸灵素的高效浓缩，为后续精细分离奠定基础，是楸灵素分离的关键技术之一。
[0077]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
【权利要求】
1.一种从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 步骤一、调整楸树内生真菌发酵液pH为4?10 ; 步骤二、预冷PH调整后的楸树内生真菌发酵液至预冷温度O?4°C ; 步骤三、在保持晶核存在的情况下对步骤二所得楸树内生真菌发酵液进行缓慢降温至结冰； 步骤四、继续缓慢降温结冰，直至未结冰发酵液体积与发酵液总体积比为设定值；停止降温，收集未结冰的发酵液，即得楸灵素浓缩液。
2.根据权利要求1所述的从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法，其特征在于，步骤一中，所述楸树内生真菌发酵液的pH为8?10。
3.根据权利要求1所述的从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法，其特征在于，步骤二中，所述楸树内生真菌发酵液的预冷温度为IV。
4.根据权利要求1所述的从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法，其特征在于，步骤三中，所述缓慢降温中的传热温差不大于6°C。
5.根据权利要求1所述的从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法，其特征在于，步骤四中，所述缓慢降温中的传热温差不大于4°C。
6.根据权利要求1所述的从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法，其特征在于，步骤三、四中，所述缓慢降温的方式包括持续加入晶核。
7.根据权利要求6所述的从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法，其特征在于，所述晶核包括O V碎冰。
8.一种从楸树内生真菌发酵液中浓缩分离楸灵素的方法的应用，所述应用具体为，用于溶液中溶质的浓缩、分离。
【文档编号】C07G99/00GK104387425SQ201410532262
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月11日 优先权日:2014年10月11日
【发明者】苗志奇, 朱闪烁, 胡郁楠, 冯婷婷, 胡丹 申请人:上海交通大学