一种复合微生物发酵制备饲料添加剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药发酵饲料添加剂生产技术领域，具体涉及一种复合微生物发酵制备饲料添加剂的方法。
【背景技术】
[0002]中药发酵就是采用微生物发酵方法生产中药。在传统的中药生产中的中药炮制就利用了天然微生物中药发酵以提高中药药效、消除中药毒副作用、改变中药药性。现代的中药发酵采用了现代微生物发酵技术，有目的地选择微生物和中药搭配进行中药发酵，其代谢理论、药效成分理念不同于传统的中药发酵，生产可控性好，药效更高、更好、更新。
[0003]目前公认的主要作用机理有以下几个方面:(I)药效更高，100%吸收:肠道益生菌发酵中药，有效成分小分子化，易于吸收;药用真菌发酵中药，有效成分提高;微生物的葡萄糖苷酶将糖苷转变成苷元;微生物的酶使植物细胞中的中药成分溶出；(2)无毒副作用，口感更好:发酵过程微生物的代谢产物能分解毒素，同时能够改善中药口感，矫味；(3)药效更新:微生物的菌体和代谢物，中药成分的微生物转化作用，中药成分的代谢调控作用，微生物成分与中药成分的相互作用等等，以上的种种因素均可以产生新药效成分或为中药活性成分修饰提供新途径；(4)中药中也含有糖类、蛋白质等营养成分，微生物代谢产生的消化酶能促进营养成分的更好消化吸收；(5)药效提高，疗效提速。与传统中药相比，发酵后中药的药效提高4-28倍，且吸收后30分钟到达血液。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种复合微生物发酵制备饲料添加剂的方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种复合微生物发酵制备饲料添加剂的方法，包括以下步骤:①按固液比2.5kg:1L?5kg:1L向固体物料中加入水，灭菌，冷却至33?38°C，得固液混合物；其中，所述固体物料由下述重量份数的原料组成:杜仲叶粉1-10份、构树叶粉1-1 O份、黄芪提取物1-5份、麸皮1-3份、碳酸钙0.05-0.3份；
②粪肠球菌种子液的制备:将活化后的粪肠球菌接种于粪肠球菌液体培养基上，37?39°C培养24小时;枯草芽孢杆菌种子液的制备:将活化后的枯草芽孢杆菌接种于枯草芽孢杆菌液体培养基上，33?37 °C培养24小时;凝结芽孢杆菌种子液的制备:将活化后凝结芽孢杆菌接种于凝结芽孢杆菌液体培养基上，33?37 °C培养24小时；
③将步骤②制备的粪肠球菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液按体积比(1-10):(1-10):(1-10)混合，得混合种子液，将混合种子液接种于步骤①灭菌后得到的固液混合物，温度35-40°C下发酵48-72小时，干燥至含水量〈6%，即得到饲料添加剂。
[0006]所述粪肠球菌液体培养基的配方为:蛋白胨30?50g/L，葡萄糖30?40 g/L，食盐5?10 g/L，肝粉5?7 g/L，pH 6.5;枯草芽孢杆菌液体培养基的配方为:酵母浸粉3-5g/L，葡萄糖10-20g/L，硫酸镁3-5g/L,pH 6.0；凝结芽孢杆菌液体培养基的配方为:酵母浸粉3_5g/L，胰蛋白胨2-5g/L，葡萄糖10-20g/L，氯化I丐3-5 g/L,pH 6.0。
[0007]所述步骤①中灭菌是在灭菌锅中121°C灭菌30分钟。
[0008]所述步骤③中混合种子液的接种重量为步骤①中固液混合物重量的10?20%。
[0009]所述步骤②中粪肠球菌活化是斜面培养基上于38°C下培养24小时进行活化，粪肠球菌活化所用斜面培养基的配方为:蛋白胨30?50 g/L，葡萄糖30?40 g/L，食盐5?10 g/L,肝粉5?7 g/L，琼脂15g/L,pH 6.5；枯草芽孢杆菌活化是斜面培养基上于35°C下培养24小时进行活化，枯草芽孢杆菌活化所用斜面培养基的配方为:酵母浸粉3_5g/L，葡萄糖10-20g/1，硫酸镁3-58/1，琼脂15-20 g/L，pH 6.0;凝结芽孢杆菌活化是斜面培养基上于35°C下培养24小时进行活化，凝结芽孢杆菌液体培养基的配方为:酵母浸粉3-5g/L，胰蛋白胨2-5g/L，葡萄糖 10-20g/L，琼脂 15-20 g/L，氯化钙3-5 g/L,pH 6.0。
[0010]所述黄芪提取物可以市购现有的黄芪提取物;优选的，所述黄芪提取物的制备方法如下:向黄芪粉中加入水，水的加入质量为黄芪粉质量的8倍，40-50°C下浸渍4小时，然后回流提取2小时，得滤渣和滤液；向滤渣中加入6倍于滤渣质量的水，回流提取2小时，过滤，然后合并两次得到的滤液，浓缩至密度为1.15-1.25g/ml，加入乙醇得到混合物，混合物中乙醇质量含量为75%，静置8小时，抽去上清液，将沉淀干燥，即为黄其提取物。
[0011]固体物料中杜仲和黄芪提取物所含的糖类物质作为碳源，杜仲和构树中的蛋白质和氨基酸作为氮源，其所含的维生素和胡萝卜素作为生长因子，促进乳酸菌(粪肠球菌、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌)的生长，麸皮能促进芽孢菌芽孢的产量。
[0012]本发明中采用的有益效果是:采用本发明中菌群组合，创新性的利用其优势摒弃其缺点。首先，粪肠球菌的代谢产物肽聚糖对免疫低下和反复呼吸道感染等有明显疗效，但是粪肠球菌经过胃酸后死亡率较高，凝结芽孢杆菌耐胃酸能力强，且无耐药性，稳定性好；枯草芽孢杆菌能代谢一些脂肪酶，纤维素酶对固体物料的深度降解具有很好的作用。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。以下实施例中粪肠球菌采购于北京北纳创联生物技术研究院，编号LICC10319，拉丁学名:Enterococcus faecalis ;枯草芽孢杆菌采购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC 20445，拉丁学名:Baci I Ius subtil is;凝结芽孢杆菌采购于青岛东海药业有限公司，菌株为凝结芽孢杆菌TBC169，拉丁学名:Bacillus coagulans。所用的猪肝粉购自于三门峡百特生化有限公司。
[0014]实施例1
一种复合微生物发酵制备饲料添加剂的方法，包括以下步骤:①按固液比4kg:1L向固体物料中加入水，在灭菌锅中121°C灭菌30分钟，冷却至38 °C，得固液混合物;其中，所述固体物料由下述重量份数的原料组成:杜仲叶粉5份、构树叶粉5份、黄芪提取物3份、麸皮2份、碳酸钙0.1份；
②粪肠球菌种子液的制备:将活化后的粪肠球菌接种于粪肠球菌液体培养基上，38°C培养24小时;枯草芽孢杆菌种子液的制备:将活化后的枯草芽孢杆菌接种于枯草芽孢杆菌液体培养基上，35 °C培养24小时;凝结芽孢杆菌种子液的制备:将活化后凝结芽孢杆菌接种于凝结芽孢杆菌液体培养基上，35 °C培养24小时；
③将步骤②制备的粪肠球菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液按体积比5:5:4混合，得混合种子液，将混合种子液接种(混合种子液的接种重量为步骤①中固液混合物重量的15%)于步骤①灭菌后得到的固液混合物，温度38°C下发酵48小时，在干燥箱中43°C下干燥至含水量〈5%，即得到饲料添加剂。
[0015]所述粪肠球菌液体培养基的配方为:蛋白胨40g/L，葡萄糖35 g/L，食盐8 g/L，猪肝粉6 g/L,pH 6.5;枯草芽孢杆菌液体培养基的配方为:酵母浸粉58/1，葡萄糖158/1，硫酸镁5g/L，pH 6.0;凝结芽孢杆菌液体培养基的配方为:酵母浸粉3g/L，胰蛋白胨2g/L，葡萄糖15g/L，氯化钙5 g/L,pH 6.0ο
[0016]所述步骤②中粪肠球菌活化是斜面培养基上于38°C下培养24小时进行活化，粪肠球菌活化所用斜面培养基的配方为:蛋白胨40 g/L，葡萄糖35 g/L，食盐8 g/L，猪肝粉6 g/L，琼脂15 g/L,pH 6.5;枯草芽孢杆菌活化是斜面培养基上于35°C下培养24小时进行活化，枯草芽孢杆菌活化所用斜面培养基的配方为:酵母浸粉5g/L，葡萄糖15g/L，硫酸镁5g/L，琼脂20 g/L,pH 6.0;;凝结芽孢杆菌活化是斜面培养基上于35°C下培养24小时进行活化，凝结芽孢杆菌液体培养基的配方为:酵母浸粉3g/L，胰蛋白胨2g/L，葡萄糖15g/L，琼脂18 g/L，氯化钙5 g/L,pH 6.0ο
[0017]所述黄芪提取物的制备方法如下:向黄芪粉中加入水，水的加入质量为黄芪粉质量的8倍，45°C下浸渍4小时，然后回流提取2小时，得滤渣和滤液；向滤渣中加入6倍于滤渣质量的水，回流提取2小时，过滤，然后合并两次得到的滤液，浓缩至密度为1.2g/ml，加入乙醇得到混合物，混合物中乙醇质量含量为75%，静置8小时，抽去上清液，将沉淀干燥，即为黄其提取物。
[0018]实施例2
一种复合微生物发酵制备饲料添加剂的方法，包括以下步骤:①按固液比2.5kg:1L向固体物料中加入水，在灭菌锅中121 °C灭菌30分钟，冷却至35 °C，得固液混合物;其中，所述固体物料由下述重量份数的原料组成:杜仲叶粉I份、构树叶粉10份、黄芪提取物I份、麸皮3份、碳酸钙0.3份；
②粪肠球菌种子液的制备:将活化后的粪肠球菌接种于粪肠球菌液体培养基上，37°C培养24小时;枯草芽孢杆菌种子液的制备:将活化后的枯草芽孢杆菌接种于枯草芽孢杆菌液体培养基上，33 °C培养24小时;凝结芽孢杆菌种子液的制备:将活化后凝结芽孢杆菌接种于凝结芽孢杆菌液体培养基上，33 °C培养24小时；
③将步骤②制备的粪肠球菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液按体积比1:10:1混合，得混合种子液，将混合种子液接种(混合种子液的接种重量为步骤①中固液混合物重量的20%)于步骤①灭菌后得到的固液混合物，温度35°C下发酵72小时，鼓风干燥箱中40°C下干燥至含水量〈5%，即得到饲料添加剂。
[0019]所述粪肠球菌液体培养基的配方为:蛋白胨30g/L，葡萄糖40 g/L，食盐5 g/L，猪肝粉5 g/L,pH 6.5;枯草芽孢杆菌液体培养基的配方为:酵母浸粉38/1，葡萄糖2(^/1，硫酸镁4 g/L,pH 6.0;凝结芽孢杆菌液体培养基的配方为:酵母浸粉5g/L，胰蛋白胨3g/L，葡萄糖 10g/L，氯化I丐3 g/L,pH 6.0ο
[0020]所述步骤②中粪肠球菌活化是斜面培养基上于38°C下培养24小时进行活化，粪肠球菌活化所用斜面培养基的配方为:蛋白胨30 g/L，葡萄糖40 g/L，食盐5 g/L，猪肝粉5 g/L，琼脂20 g/L,pH 6.5;枯草芽孢杆菌活化是斜面培养基上于35°C下培养24小时进行活化，枯草芽孢杆菌活化所用斜面培养基的配方为:酵母浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，硫酸镁4g/L，琼脂15 g/L,pH 6.0;;凝结芽孢杆菌活化是斜面培养基上于35°C下培养24小时进行活化，凝结芽孢杆菌液体培养基的配方为:酵母浸粉5g/L，胰蛋白胨3g/L，葡萄