本发明涉及饲料添加剂制备技术领域，尤其涉及一种保护猪肝脏的微生物饲料添加剂及其制备方法。
背景技术：
肝脏是猪体内最大的腺体，肝细胞产生的许多物质可以直接释放入血液中，影响和调节机体的代谢和生理活动。另外肝脏还有导管系统，生成的胆汁能经胆管排入十二指肠。因此肝脏具有内分泌腺和外分泌腺的性质。肝脏丰富的血液供应和独特的生态结构使其代谢极为活跃，不仅在糖、脂、蛋白质、维生素和激素等代谢方面与各个组织器官密切相关，而且具有分泌、排泄和生物转化等重要功能。
然而，随着规模养猪业的飞速发展，猪群受不良的养殖观念影响和危害极其严重。霉变饲料的饲喂，长期大量、超量抗生素的使用，养殖密度大造成的空气质量恶劣等因素，直接或间接造成猪的肝脏、肾脏严重损伤，从而导致猪群的免疫力下降甚至免疫抑制，使猪长期处于亚健康状态（“底色病”），为各种疫病的入侵提供了可乘之机，风吹草动一下，猪即发病。此外，环境变化应激和疾病造成的生理病理负担也对肝脏造成很大压力。在各种压力之下，肝脏疲于应付，正常功能受到影响。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中的缺陷，提出一种促进肉猪肝脏抗氧化能力的微生物饲料添加剂及其制备方法，为实现该技术目的，本发明的技术方案为：
一种保护猪肝脏的微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于，采用菌种复合培养方法，使菌种在同一培养基中驯化培养，其制备步骤为：
第一步：菌种筛选和生产制种
a. 菌株筛选：菌种来源健康猪小肠，采用乳酸菌培养基MRS进行乳酸菌分离，筛选植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌；在啤酒发酵液中用麦氏琼脂培养基分离酿酒酵母菌在实验室中作菌株保存；
b. 将分离的植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌分别接种于肉汤培养基中，同时添加0.1-1％比例的亚硒酸钠，在28－35℃温度下培养20－25小时，然后将酿酒酵母菌接种于麦氏琼脂培养基、枯草芽孢杆菌接种于营养琼脂培养基，植物乳杆菌接种于步骤a中的乳酸菌培养基中，进行划线培养，选出生长快、菌体特征明显的酿酒酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，在实验室中保存；
c. 生产制种：将步骤b的酿酒酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌分别转接入装有PDA和MRS营养琼脂培养基的茄子瓶中，在28－35℃温度下培养40－50小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出，然后放入2－6℃的冰箱中进行保存；
第二步：复合菌剂制作
a. 按以下重量配比称取茄子瓶中各生产菌种：植物乳杆菌5－10％、酿酒酵母菌70－85％、枯草芽孢杆菌10－20％；
b. 将生产菌种混合，将混合后的菌种按复合菌剂重量比例的4－6％添加在由糖蜜2-6%、蛋白胨0.5-1%、葡萄糖2-4%、氯化钠0-1%、酵母膏2-6％、硫酸镁0-1%、水81-93.5％组成的复合菌剂培养基中， 调节ph值至6－8，放入容器中加温至110－130℃进行灭菌15－20分钟，冷却至28－35℃后在发酵罐中发酵6-8小时，通气量10-50L/小时，搅拌速度180-250rpm；
第三步：复合菌剂扩大和驯化培养
a. 将复合菌剂按以下重量配比与炭源、氮源、无机盐及诱导剂混合：复合菌剂5-15%、碳源2-15%、氮源 2-10%、无机盐 0.5－1%、 亚硒酸钠 0.1-1%、水58－90.4％混合置入密闭罐中，110－130℃进行灭菌15－20分钟，冷却至28－35℃后在发酵罐中发酵20-30小时，通气量10-50L/小时，搅拌速度180-250rpm，4小时后用50%灭菌过的糖蜜补料，30-60L/小时，直至发酵结束；
B. 发酵过程中取样三次，测定谷胱甘肽含量、pH值3.5-4；
第四步：粉碎过筛
a. 将发酵液加入2%的硅藻土在100-125℃下喷雾干燥干燥2-3S，，干燥后的产品过80目筛，筛出的粗料再进行粉碎和过筛，
b. 过筛后装入包装袋中，转入成品库有序堆放，通知品管部门取样检测，主要参数：水份≤12.0%、活菌数≥100亿/g、谷胱甘肽100mg/100g；物理性状：淡黄色粉末状固体。
所述的复合菌剂由植物乳杆菌、酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌组成，其重量百分配比为：植物乳杆菌5－10％、酿酒酵母菌70－85％、枯草芽孢杆菌10－20％。
所述的碳源为糖蜜、葡萄糖之一或它们的混合物；所述的氮源为豆饼粉、菜粕粉、酵母粉、玉米浆之一或它们的混合物；所述的无机盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾之一或它们的混合物。
另一方面，本发明还提供通过上述方法制备得到的保护猪肝脏的微生物饲料添加剂。
本发明采用在健康猪小肠中取食糜为菌源中筛选出的菌种与有机营养物质
混合，通过微生物发酵技术制成，它含有多种活性酶、小肽、游离氨基酸、单体
蛋白、抗氧化物质、维生素及抗菌物质，有益菌活菌数的数量达到了100亿/克；
在健康猪的肠道中存活着多种细胞构成的菌群，当本发明产品的有益微生物进入猪道后，结合原有的有益菌，迅速形成优势微生物菌群，抑制了肠道有害菌的生长，其中的有益微生物在肠道壁周围通过磷壁酸与肠粘膜上皮细胞紧密结合，形成菌膜屏障，阻止有害菌的定植；复合微生物还可以产生抗菌物质、乳糖菌素、杆菌肽等，抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌在肠道内的繁殖、定植和吸附、中和毒性产物，抑制氨和胺的合成，促进肠道相关淋巴组织的高度反应能力。
本发明产品中所含的谷胱甘肽其所含有的巯基可以充分与体内自由基结合而使自由基还原且促进超氧化物歧化酶合成而提高自由基清除率，同时还原性谷胱甘肽可以通过激活多种酶类等途径促进糖类、脂肪及蛋白质等多种物质代谢且对药物、生物毒性损伤所致肾功能损害起到解毒、稳定细胞膜、保持其完整性和促进药物及细胞代谢等多种功效。作为一种非肽类内皮素拮抗剂可以有效拮抗内皮素、调节血管舒缩、保护肝脏血管内皮，因此对改善肝功能、保护肝脏具有十分重要的价值。
本发明产品中所含的活性微生物利于营养物的吸收提高饲料的利用率及能量，降低料重比；可减少外加无机酸盐，减少粪便磷的排放，减轻对环境的污染，而且还可以提高被结合的蛋白质、矿物元素的利用，提高消化率。
本发明产品采用碳源、氮源、无机盐及亚硒酸钠作为菌种培养原料，它们是微生物细胞结构和酶的重要组成部分，还可维持酶的活性，能促进微生物生长繁殖，刺激活性酶及小肽的生成。
本发明从生态绿色养殖的目的入手，选育自然界中分离的益生素菌种，以农业废料原料为培养基，通过多级的富集发酵，产生高浓度的有益于对饲料中多种成分消化和吸收的有益菌群，同时生产谷胱甘肽及小肽等物质的添加剂，在饲料中直接添加，可以提高猪肝脏抗氧化活性，可通过促进垂体GH的分泌,GH可能通过上调肝脏GHR基因转录水平和GHR水平,增强肝脏、半腱肌IGF-1基因转录,降低脂肪细胞IGF-1基因转录,使血清IGF-1水平提高,进而促进蛋白合成、提高养分利用率,最终促进猪的生长。肝脏能净化被动物吸收的霉菌毒素，此净化过程基于谷胱甘肽的氧化还原反应，可以减轻毒素侵害。本发明是一种安全、高效的绿色饲料添加剂。
综上所述，本发明相对于现有技术的的优点是：
1.采用独创的复合培养及驯化相结合的发酵技术，避免了各菌种的拮抗机制，使发酵产物得到最优化；
2.整个生产工艺最大程度上得到有益微生物最大化，发酵最主要产物谷胱甘肽胞内胞外全部回收；
3.产品中含有促进饲料采食量的乳酸，还有发酵中产生的纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶等多种活性酶，与有益菌群共同作用，使饲料中的营养充分吸收利用。
4.本发明中最主要原料是农业副产物糖蜜，再加上采用粮食作物和常用饲料载体作为主要培养基原料，生产成本低，易于在养殖中推广。
5.本发明的产品采用饲料工业中2045（2013年）公告的菌种进行发酵，在保证改善猪自身免疫系统和生长发育，还能加快抗生素、重金属和毒素代谢，符合生态农业的要求，为人民提供安全绿色产品提供保障。
具体实施方式
本发明提供了一种保护猪肝脏的微生物饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤a. 菌株筛选：菌种来源健康猪小肠，采用乳酸菌培养基进行乳酸菌分离，筛选植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌；在啤酒发酵液中用麦氏琼脂培养基分离酿酒酵母菌；
步骤b. 将分离的植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌分别接种于肉汤培养基中，同时添加0.1-1％比例的亚硒酸钠，在28－35℃温度下培养20－25小时，然后将酿酒酵母菌接种于麦氏琼脂培养基，枯草芽孢杆菌接种于营养琼脂培养基，植物乳杆菌接种于乳酸菌培养基中，进行划线培养，选出生长快、菌体特征明显的酿酒酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，保存；
步骤c. 生产制种：将步骤b中获得的酿酒酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌分别转接入装有PDA和MRS营养琼脂培养基的培养瓶中，在28－35℃温度下培养40－50小时，待培养瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出，然后放入2－6℃的冰箱中进行保存备用；
步骤d. 按重量配比称取步骤c中培养瓶中保存备用的各生产菌种，然后将三者混合；
步骤e. 将混合后的生产菌种按复合菌剂重量比例的4－6％添加在复合菌剂培养基中， 调节ph值至6－8，放入容器中加温至110－130℃进行灭菌15－20分钟，冷却至28－35℃后在发酵罐中发酵6-8小时，获得复合菌剂；
步骤f. 将步骤e获得的复合菌剂与炭源、氮源、无机盐、诱导剂及水混合，110－130℃进行灭菌15－20分钟，冷却至28－35℃后在发酵罐中发酵20-30小时，通气量10-50L/小时，搅拌速度180-250rpm，4小时后用50%灭菌过的糖蜜补料，30-60L/小时，直至发酵结束；
步骤g. 将发酵液加入2%的硅藻土在100-125℃下喷雾干燥干燥2-3S，干燥后的产品过80目筛，筛出的粗料再进行粉碎和过筛，获得保护猪肝脏的微生物饲料添加剂。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
第一步：菌种筛选和生产制种
a. 菌株筛选：在健康鹅小肠中取食糜为菌源，采用由MRS培养基的乳酸菌培养基进行乳酸菌分离、筛选植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌；在啤酒发酵液中用PDA琼脂培养基分离酿酒酵母菌在实验室中作菌株保存，本发明使用如下菌种：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum（ATCC8014）、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae（IFO0203）、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis （ACCC10623）；
b. 将分离的植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌分别接种于肉汤培养基中，同时添加0.5％比例的亚硒酸钠，在30℃温度下培养24小时，然后将酿酒酵母菌接种于由葡萄糖1g、氯化钾1.8g、酵母浸膏2。5g、醋酸钠8.2g、琼脂15－20g、蒸馏水1000ml组成的麦氏（Meclary）琼脂培养基中，枯草芽孢杆菌接种于由牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15－20g、水1000ml、pH7.0-7.2组成的营养琼脂（LB培养基），植物乳杆菌接种于步骤a中的乳酸菌培养基中，进行划线培养，选出生长快、菌体特征明显的酿酒酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，在实验室中保存；
c. 生产制种：将步骤b的酿酒酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，在30℃温度下培养45小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出;然后放入4℃的冰箱中进行保存;
以上分离培养基在实验室操作手册中均可查到。
第二步：复合菌剂制作
a. 按以下重量配比称取茄子瓶中各生产菌种：植物乳杆菌10％、酿酒酵母菌80％、枯草芽孢杆菌10％。
b. 将生产菌种混合，按培养基重量的4％比例添加在由糖蜜4%、蛋白胨0.8%、葡萄糖3%、氯化钠0.5%、酵母膏2％、硫酸镁0.05%、水89.65%组成的复合菌剂培养基中，ph值调节至7.0，放入容器中加温至120℃进行灭菌15分钟，冷却至30℃后发酵罐中发酵8小时，通气量20L/小时，搅拌速度200rpm；
第三步：复合菌剂扩大和驯化培养
a.将复合菌剂按重量配比与炭源、氮源、无机盐及诱导剂混合：复合菌剂
10％转接入含有糖蜜4％（碳源）、豆饼粉2％（氮源）、磷酸氢二钾0.4，磷酸二氢钾0.2％（无机盐）、亚硒酸钠0.5％、水92.9％混合置入密闭罐中，加温至120℃进行灭菌15分钟，冷却至30℃后在发酵罐中发酵24小时，通气量40L/小时，搅拌速度200rpm，4小时后用50%灭菌过的糖蜜补料，36L/小时，直至发酵结束；
b. 发酵过程中取样三次，测定谷胱甘肽含量、pH值3.5-4。
第四步：粉碎过筛
a. 将发酵液加入2%的硅藻土在115℃下喷雾干燥干燥2.5S，，干燥后的产品过80目筛，筛出的粗料再进行粉碎和过筛，
b.过筛后装入包装袋中，转入成品库有序堆放，通知品管部门取样检测，主要参数：水份≤12.0%、活菌数≥100亿/g、谷胱甘肽100mg/100g；物理性状：淡黄色粉末状固体。
实施例2
第一步:菌种筛选和生产制种同实施例1相同；
第二步：复合菌剂制作
a. 按以下重量配比称取茄子瓶中各生产菌种：植物乳杆菌8％、酿酒酵母菌80％、枯草芽孢杆菌12％。
b. 将生产菌种混合，按培养基重量的4％比例添加在由糖蜜5%、蛋白胨0.6%、葡萄糖3%、氯化钠0.8%、酵母膏2.5％、硫酸镁0.08%、水88.02%组成的复合菌剂培养基中，ph值调节至7.0，放入容器中加温至121℃进行灭菌15分钟，冷却至30℃后发酵罐中发酵8小时，通气量25L/小时，搅拌速度180rpm；
第三步：复合菌剂扩大和驯化培养
a.将复合菌剂按重量配比与炭源、氮源、无机盐及诱导剂混合：复合菌剂
15％转接入含有糖蜜5％（碳源）、豆饼粉2.5％（氮源）、磷酸氢二钾0.5，磷酸二氢钾0.25％（无机盐）、亚硒酸钠0.8％、水90.95％混合置入密闭罐中，加温至121℃进行灭菌15分钟，冷却至30℃后在发酵罐中发酵26小时，通气量30L/小时，搅拌速度220rpm，4小时后用50%灭菌过的糖蜜补料，30L/小时，直至发酵结束；
b. 发酵过程中取样三次，测定谷胱甘肽含量、pH值3.5-4。
第四步：粉碎过筛
a. 将发酵液加入2%的硅藻土在118℃下喷雾干燥干燥2.5S，，干燥后的产品过80目筛，筛出的粗料再进行粉碎和过筛，
b.过筛后装入包装袋中，转入成品库有序堆放，通知品管部门取样检测，主要参数：水份≤12.0%、活菌数≥100亿/g、谷胱甘肽100mg/100g；物理性状：淡黄色粉末状固体。
将实施例1和2中获得添加剂使用时按200-400ppm比例添加到猪饲料中并搅拌均匀，然后测定相关指标。本产品使用在饲料中每日猪摄食量将明显增加，测试血清中是SOD含量比对照提高了20%，MDA下降了10%以上，在上海农科院饲料研究开发中心进行的对比试验中，添加200ppm本发明制备的产品，育肥猪日增重分别提高11.67%；饲料转化率提高8.9%；胴体瘦肉率提高5.80%。可见,育肥猪日粮中添加本产品在促生长、提高瘦肉率、节约饲料等方面效果显。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。