专利名称：具有厌氧腐殖质呼吸能力还原菌的分离纯化及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种具有厌氧腐殖质呼吸能力还原菌的分离纯化及鉴定方法。
背景技术：
厌氧腐殖质呼吸(Anaerobic humus respiration)首次报道于1996年，它是 一个以有机碳源为电子供体，以腐殖质(醌类物质，如蒽醌-2，6-双磺酸盐AQDS、 蒽醌-2-磺酸盐AQS、腐殖酸)为唯一末端电子受体，偶联能量的产生，支持菌 体生长的复杂生物化学反应过程，这个过程的反应产物为还原态腐殖质(例 如acetate+4H20+4AQDS—4AH2DS+2HC(V+P^ , lactate>2H20 +2AQDS— ZAHzDS+acetate'+HCXV+ir) [1]。在厌氧条件下，某些微生物可以腐殖质作为唯 一电子受体，氧化环境中的不同污染物质。在微生物呼吸领域，它突破了传统 的腐殖质对微生物代谢非活性理论，人们以此为基础研创了崭新的腐殖质/腐殖 质还原菌协同还原金属和降解有机或无机污染物技术，如腐殖质/腐殖质还原菌 协同还原金属Fe3+、腐殖质/腐殖质还原菌协同降解偶氮染料和腐殖质/腐殖质还 原菌协同降解甲苯等。这些腐殖质/腐殖质还原菌协同作用所涉及的微生物为异 养细菌，腐殖质则是一种难微生物降解的复杂有机物，其还原态在被氧化后又 可被腐殖质还原菌还原而实现氧化态腐殖质和还原态腐殖质之间循环。腐殖质/ 腐殖质还原菌协同作用不但在外加有机碳源存在下，可以不断循环还原重金属 难降解有机物，而且在没有外加碳源的情况下可以某些有机污染物作为电子供 体将其降解，考虑到腐殖质和具有腐殖质呼吸能力的微生物的广泛存在，可以 以此为厌氧污染环境的原位修复提供依据。
在自然生态系统中，由于腐殖质物质广泛存在，以及可作为微生物碳源的 有机质的广泛存在，常常发生腐殖质还原微生物以有机碳源作为电子供体，以 腐殖质作为唯一受体的电子传递即腐殖质呼吸的现象。现已证明，在有机质含 量丰富的沉积物、污染的土壤以及废水处理的活性污泥中，都可检测到厌氧腐 殖质呼吸P"W。有机质含量丰富的的自然生境样品或人工生境样品是厌氧腐殖质
还原菌的良好分离源。
迄今为止，文献报道的具厌氧腐殖质呼吸能力的还原菌有许多种，分别归 于不同类型的还原菌中，如Fe(III)还原菌[(GeoZ^^spp.;P、硝酸盐还原菌 (tS7 evv(3we〃apw化ey^c/ews )[4]、硫还原菌(Z)&si^/l^o附owos spp.)[5]、发酵细菌(iVo/ ,o"z't"cfer/ww,ewcfe";-ez'c/n7 )问、嗜热产甲院古细菌等等(A/erta"ococcw51
f/^T^/^O/rap/^W"。这些厌氧腐殖质还原菌都是利用采用传统方法分离获得
的菌种再经腐殖质还原鉴定而确定为具有腐殖质呼吸能力的还原菌的。
参考文献 Lovley D， Coates J, Blunt-Harris EL， w a/.腐殖质作为电子受体用于微生物呼吸.自然(Humic substances as electron acceptors for microbial respiration. Nature,) 1996， 382:445-448. Maurice Q Sander A, Bas Godschalk， e/ a/.氯呼吸菌和相关生物对醌类物质的厌氧还原和氧化及对氧化 态金属的还原 (Anaerobic reduction and oxidation of quinone moieties and the reduction of oxidized metals by halorespiring and related organisms. FEMS Microbiol Ecol.) 2004, 49:145-150. Coates J， Ellis D, Blunt-Harris E， a/.来源于多种环境的腐殖质还原菌的富集，应用环境微生物 (Recovery of Humic-Reducing Bacteria from a Diversity of Environments. Appl Environ Microbiol) ， 1998 ， 64(4): 1504-1509. Lovley D， Fraga J， Blunt-Harris E， W a/.腐殖质物质作为中介体用于微生物催化还原金属，金属催化还原
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发明内容本发明提供一种具有厌氧腐殖质呼吸能力还原菌的分离纯化及鉴定方法。 具有厌氧腐殖质呼吸能力还原菌的分离纯化方法包括如下步骤-
1) 选取富含有机质的自然生境和人工生境样品作为具有厌氧腐殖质呼吸能 力的还原菌的分离源，自然生境样品是湖泊底泥，人工生境样品是城市污水处
理厂厌氧消化池污泥；
2) 在分离源中加入作为富集基质的液体培养基，液体培养基中含有6mM 甲酸钠、3mM乙酸钠或lmM葡萄糖，还含有腐殖质模式物蒽醌-2,6-双磺酸盐 的基本无机盐液体，每隔5 7天再加入6mM甲酸钠、3mM乙酸钠或lmM葡 萄糖和基本无机盐液体，并充氧将橙红色还原态蒽醌-2，6-双磺酸盐氧化为浅黄色 的蒽醌-2，6-双磺酸盐，然后用氮气将多余氧气赶出，如此连续重复7 9次，驯 化富集厌氧腐殖质还原颗粒污泥；
3) 取富集而得厌氧腐殖质还原颗粒污泥，用超声波破碎，制成初级菌悬液，
再逐级稀释制成系列菌悬液；
4) 将系列菌悬液接种于融化的固体培养基中，在28-30'C下进行厌氧滚管法
培养，用毛细管将厌氧滚管上长出的橙红色单菌落挑入液体培养基中，在 28-3(TC下厌氧培养7-10天，培养后，再采用厌氧滚管法分离单菌落，如此重复 4 5次，当在显微镜下观察到的细菌细胞形态一致时，获得具有腐殖质呼吸能 力纯菌群。
所述的液体培养基配方为NH4C1 1500 mg/L， NaH2P04 600 mg/L， CaCl2.2H20 100 mg/L， KC1 100 mg/L， MgCl2.6H20 2 mg/L， MnCl2.4H20 5 mg/L， NaMo04.2H20 1 mg/L，蒽醌-2，6-双磺酸盐1 mM, 6mM甲酸钠、3mM乙酸钠或 lmM葡萄糖c
所述的固体培养基为在上述液体培养基中再添加琼脂20 g/L。 具有厌氧腐殖质呼吸能力的还原菌的鉴定方法包括如下步骤
1) 将具有腐殖质呼吸能力纯菌群，在5000rpm离心收获菌体细胞，用液体 培养基制成菌体悬液，以厌氧条件下，腐殖质模式物蒽醌-2,6-双磺酸盐还原为橙 红色还原态蒽醌-2,6-双磺酸盐的能力，判断该菌株是否为腐殖质还原菌；
2) 以菌体形态和16SrDNA序列确定菌株的分类地位，菌体形态包括培养菌 落的观察和培养菌体的观察以及菌体细胞结构的观察，16SrDNA序列的测定步 聚包括提取菌株基因组DNA， PCR扩增16SrDNA，纯化16SrDNA，测定16S rDNA序歹U，将测得的16S rDNA序列与GenBank(www.ncbi com)中已有的16S rDNA序列比对，确定菌株的分类地位。本发明的优点l)可以获得厌氧腐殖质还原菌的纯培养物，为微生物学研究 和工业化应用提供菌种；2)了解被分离菌株的生理生化特性，便于菌种保藏和大 量扩增；3)鉴定程序简单，结果可信。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅 限于此。
实施例1
厌氧腐殖质还原菌分离鉴定的步骤如下
1、 本例选取湖泊底泥作为厌氧腐殖质呼吸能力的还原菌的分离源。
2、 以添加6mM甲酸钠并含lmMAQDS (蒽醌-2,6-双磺酸盐)的基本无机 盐液体培养基作为富集基质，采用分批培养的方式，培育厌氧腐殖质还原颗粒 污泥，每隔5 7天再加入6mM甲酸钠和基本无机盐液体，并充氧将橙红色还 原态蒽醌-2,6-双磺酸盐氧化为浅黄色的蒽醌-2,6-双磺酸盐，然后用氮气将多余氧 气赶出，如此连续重复7 9次，驯化富集厌氧腐殖质还原颗粒污泥；；
3、 取富集而得厌氧腐殖质还原颗粒污泥，用超声波破碎，制成菌悬液，再 逐级系列稀释制成菌悬液。
4、 将系列菌悬液接种于融化的固体培养基中，在28-3(TC下进行厌氧滚管 法培养，用毛细管将厌氧滚管上长出的橙红色单菌落挑入液体培养基中，在 28-3(TC下厌氧培养7-10天，培养后，再采用厌氧滚管法分离单菌落，如此重复 4 5次，当在显微镜下观察到的细菌细胞形态一致时，获得具有腐殖质呼吸能 力纯菌群。
5、 以液体培养基扩增纯培养物，离心收获菌体细胞，用基本无机盐培养基 制成菌体悬液，添加AQDS及甲酸钠，以厌氧条件下将AQDS还原为橙红色的 AH2QDS (还原态蒽醌-2，6-双磺酸盐)的能力，判断该菌株是否具有厌氧腐殖质 呼吸能力。
6、 根据纯培物的形态特征和分子生物学特征，确定菌株的分类地位，具体 参照文献[12'13]进行。
1) 形态特征包括培养菌落的观察和培养菌体的观察以及菌体细胞结构的观 察。细菌细胞形态观察，按文献[11]介绍的方法染色，采用德国Leica研究显微镜
(DMLB+QCOLite)观察。
2) 分子生物学特征主要是16SrDNA序列，其测定步聚为
a)采用细菌DNA抽提试剂盒提取并纯化被分离菌的基因组DNA。b) 以细菌的总DNA为摸板，采用细菌16S rDNA的通用引物进行PCR扩 增。正向引物27F: 5-GTTTGATCCTGGCTCAG-3，;反向引物1492R: 5， -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ， 。 PCR的扩增体系为10 X PCR Buffer 2.0^1, 10mmol/LdNTPs2.(Vl， 25mmol/L MgCl2 0.8^1， 5U4d Taq DNA酶0.3^1，正向引 物与反向引物各17ng4d的模板DNA3(al，ddH20 9.9^1，反应总体积为20^1。 扩增反应94。C预变性5min后；94'C变性lmin， 55"C退火lmin， 72。C延伸2min， 共35个循环；最后于72'C补平7min，终止温度为4r。采用1.5%的琼脂糖凝 胶电泳检测16S rDNA的PCR扩增产物，采用上海培清科技有限公司的JS-380A 自动凝胶图像分析系统摄取扩增图谱。
c) 纯化16SrDNA，委托生物科技有限公司测定16S rDNA序列。
d) 将测得的16SrDNA序列与GenBank (www.ncbi.com)中己有序列的比 对，确定分离菌株的分类地位
厌氧腐殖质还原菌分离鉴定的步骤如下
1、 本例选取湖泊底泥作为具有厌氧腐殖质呼吸能力的还原菌的分离源。
2、 以添加3mM乙酸钠的含lmMAQDS的基本无机盐液体培养基作为富集 基质，采用分批培养的方式，培育厌氧腐殖质还原颗粒污泥，每隔5 7天再加 入3mM乙酸钠和基本无机盐液体，并充氧将橙红色还原态蒽醌-2,6-双磺酸盐氧 化为浅黄色的蒽醌-2,6-双磺酸盐，然后用氮气将多余氧气赶出，如此连续重复 7 9次，驯化富集厌氧腐殖质还原颗粒污泥；
3、 取富集而得厌氧腐殖质还原颗粒污泥，用超声波破碎，制成菌悬液，再 逐级系列稀释制成菌悬液。
4、 将系列菌悬液接种于融化的固体培养基中，在28-3(TC下进行厌氧滚管 法培养，用毛细管将厌氧滚管上长出的橙红色单菌落挑入液体培养基中，在 28-3(TC下厌氧培养7-10天，培养后，再采用厌氧滚管法分离单菌落，如此重复 4 5次，当在显微镜下观察到的细菌细胞形态一致时，获得具有腐殖质呼吸能 力纯菌群。
5、 以液体培养基扩增纯培养物，离心收获菌体细胞，用基本无机盐培养基 制成菌体悬液，添加AQDS及乙酸钠，以厌氧条件下将AQDS还原为橙红色的 AH2QDS的能力，判断该菌株是否具有厌氧腐殖质呼吸能力。
6、 根据纯培物的形态特征和分子生物学特征，确定菌株的分类地位，具体 参照文献[12'13]进行。1) 形态特征包括培养菌落的观察和培养菌体的观察以及菌体细胞结构的观
察。细菌细胞形态观察，按文献[11]介绍的方法染色，采用德国Leica研究显微镜 (DMLB+QCOLite)观察。
2) 分子生物学特征主要是16SrDNA序列，其测定步聚为
a) 采用细菌DNA抽提试剂盒提取并纯化被分离菌的基因组DNA。
b) 以细菌的总DNA为摸板，采用细菌16SrDNA的通用引物进行PCR扩 增。正向引物27F: 5， -GTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物1492R: 5， -GGTTACCTTGTTACGACTT-3，。 PCR的扩增体系为10XPCRBuffer 2.0pl， 10mmol/LdNTPs2.(Vl， 25mmol/L MgCl2 0.8^d， 5U/nl Taq DNA酶0.3^1，正向引 物与反向引物各l.(Vl， 17ng/Vl的模板DNA3)til，ddH20 9.9^1，反应总体积为2(^1。 扩增反应94。C预变性5min后；94。C变性lmin， 55。C退火lmin， 72。C延伸2min， 共35个循环；最后于72'C补平7min，终止温度为4t:。采用1.5%的琼脂糖凝 胶电泳检测16S rDNA的PCR扩增产物，采用上海培清科技有限公司的JS-380A 自动凝胶图像分析系统摄取扩增图谱。
c) 纯化16SrDNA，委托生物科技有限公司测定16S rDNA序列。
d) 将测得的16SrDNA序列与GenBank (www.ncbi.com)中已有序列的比 对，确定分离菌株的分类地位。本实施例与实施例1相比将甲酸钠换成乙酸钠，同样可分离到具有厌氧腐 殖质呼吸能力的还原菌。 实施例3
厌氧腐殖质还原菌分离鉴定的步骤如下
1、 本例选取湖泊底泥作为具有厌氧腐殖质呼吸能力的还原菌的分离源。
2、 以添加lmM葡萄糖并含lmMAQDS的基本无机盐液体培养基作为富集 基质，采用分批培养的方式，培育厌氧腐殖质还原颗粒污泥，每隔5 7天再加 入lmM葡萄糖和基本无机盐液体，并充氧将橙红色还原态蒽醌-2,6-双磺酸盐氧 化为浅黄色的蒽醌-2,6-双磺酸盐，然后用氮气将多余氧气赶出，如此连续重复 7 9次，驯化富集厌氧腐殖质还原颗粒污泥；
3、 取富集而得厌氧腐殖质还原颗粒污泥，用超声波破碎，制成菌悬液，再 逐级系列稀释制成菌悬液。
4、 将系列菌悬液接种于融化的固体培养基中，在28-30'C下进行厌氧滚管 法培养，用毛细管将厌氧滚管上长出的橙红色单菌落挑入液体培养基中，在 28-3(TC下厌氧培养7-10天，培养后，再采用厌氧滚管法分离单菌落，如此重复4 5次，当在显微镜下观察到的细菌细胞形态一致时，获得具有腐殖质呼吸能 力纯菌群。
5、 以液体培养基扩增纯培养物，离心收获菌体细胞，用基本无机盐培养基 制成菌体悬液，添加AQDS及葡萄糖，以厌氧条件下将AQDS还原为橙红色的 AH2QDS的能力，判断该菌株是否具有厌氧腐殖质呼吸能力。
6、 根据纯培物的形态特征和分子生物学特征，确定菌株的分类地位，具体 参照文献[12'13]进行。
1) 形态特征包括培养菌落的观察和培养菌体的观察以及菌体细胞结构的观 察。细菌细胞形态观察，按文献[11]介绍的方法染色，采用德国Leica研究显微镜
(DMLB+QCOLite)观察。
2) 分子生物学特征主要是16SrDNA序列，其测定步聚为
a) 采用细菌DNA抽提试剂盒提取并纯化被分离菌的基因组DNA。
b) 以细菌的总DNA为摸板，采用细菌16SrDNA的通用引物进行PCR扩 增。正向引物27F: 5， -GTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物1492R: 5， -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ， 。 PCR的扩增体系为10 X PCR Buffer 2.0|al， 10mmol/LdNTPs 2.(^1， 25mmol/LMgCl2 0.8^1， 5U4d Taq DNA酶0.3pl，正向引 物与反向引物各l.(Vl， 17ng/pl的模板DNA3^d,ddH20 9.9pl，反应总体积为2(^1。 扩增反应94。C预变性5min后；94。C变性lmin， 55。C退火lmin， 72。C延伸2min， 共35个循环；最后于72"C补平7min，终止温度为4"C。采用1.5%的琼脂糖凝 胶电泳检测16S rDNA的PCR扩增产物，采用上海培清科技有限公司的JS-380A 自动凝胶图像分析系统摄取扩增图谱。
c) 纯化16SrDNA，委托生物科技有限公司测定16S rDNA序列。
d) 将测得的16S rDNA序列与GenBank (www.ncbi.com)中已有序列的比 对，确定分离菌株的分类地位。
本实施例与实施例l、实施例2相比将甲酸钠、乙酸钠换成葡萄糖，同样可 分离到具有厌氧腐殖质呼吸能力的还原菌。 实施例4
厌氧腐殖质还原菌分离鉴定的步骤如下
1、 本例选取城市污水处理厂厌氧消化池污泥作为具有厌氧腐殖质呼吸能力 的还原菌的分离源。
2、 以添加6mM甲酸钠并含lmMAQDS的基本无机盐液体培养基作为富集 基质，采用分批培养的方式，培育厌氧腐殖质还原颗粒污泥，每隔5 7天再加入3mM乙酸钠和基本无机盐液体，并充氧将橙红色还原态蒽醌-2，6-双磺酸盐氧 化为浅黄色的蒽醌-2,6-双磺酸盐，然后用氮气将多余氧气赶出，如此连续重复 7 9次，驯化富集厌氧腐殖质还原颗粒污泥；
3、 取富集而得厌氧腐殖质还原颗粒污泥，用玻璃匀浆器破碎，制成菌悬液， 再逐级系列稀释制成菌悬液。
4、 将系列菌悬液接种于融化的固体培养基中，在28-30"C下进行厌氧滚管 法培养，用毛细管将厌氧滚管上长出的橙红色单菌落挑入液体培养基中，在 28-3(TC下厌氧培养7-10天，培养后，再采用厌氧滚管法分离单菌落，如此重复 4 5次，当在显微镜下观察到的细菌细胞形态一致时，获得具有腐殖质呼吸能 力纯菌群。
5、 以液体培养基扩增纯培养物，离心收获菌体细胞，用基本无机盐培养基 制成菌体悬液，添加AQDS及甲酸钠，以厌氧条件下将AQDS还原为橙红色的 AH2QDS的能力，判断该菌株是否具有厌氧腐殖质呼吸能力。
6、 根据纯培物的形态特征和分子生物学特征，确定菌株的分类地位，具体 参照文献[12，13]进行。
1) 形态特征包括培养菌落的观察和培养菌体的观察以及菌体细胞结构的观 察。细菌细胞形态观察，按文献[11]介绍的方法染色，采用德国Leica研究显微镜
(DMLB+QCOLite)观察。
2) 分子生物学特征主要是16SrDNA序列，其测定步聚为
a) 采用细菌DNA抽提试剂盒提取并纯化被分离菌的基因组DNA。
b) 以细菌的总DNA为摸板，采用细菌16SrDNA的通用引物进行PCR扩 增。正向引物27F: 5， -GTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物1492R: 5， -GGTTACCTTGTTACGACTT-3，。 PCR的扩增体系为10 X PCR Buffer 2.(VI， 10mmol/LdNTPs2.(Vl， 25mmol/L MgCl2 0.8(^1， 5U/V1 Taq DNA酶0.3nl，正向引 物与反向引物各l.(Vl， 17ng^l的模板DNA3pl，ddH20 9.9ial，反应总体积为20|J。 扩增反应94。C预变性5min后；94'C变性lmin， 55。C退火lmin， 72""C延伸2min， 共35个循环；最后于72"C补平7min，终止温度为4t。采用1.5%的琼脂糖凝 胶电泳检测16S rDNA的PCR扩增产物，采用上海培清科技有限公司的JS-380A
自动凝胶图像分析系统摄取扩增图谱。
c) 纯化16SrDNA，委托生物科技有限公司测定16S rDNA序列。
d) 将测得的16S rDNA序列与GenBank (www.ncbi.com)中已有序列的比 对，确定分离菌株的分类地位。与实施例1相比，本实施例采用不同的分离源及不同的厌氧腐殖质呼吸污 泥破碎方式同样可以分离到具有厌氧腐殖质呼吸能力的还原菌。
实施例5，对比实验
厌氧腐殖质还原菌分离鉴定的步骤如下
1、 本例选取湖泊底泥作为具有厌氧腐殖质呼吸能力的还原菌的分离源。
2、 以不含AQDS的基本无机盐液体培养基作为富集基质，采用分批培养的 方式，培育厌氧腐殖质还原颗粒污泥，每隔5 7天再加入3mM乙酸钠和基本 无机盐液体，并充氧将橙红色还原态蒽醌-2，6-双磺酸盐氧化为浅黄色的蒽醌-2，6-双磺酸盐，然后用氮气将多余氧气赶出，如此连续重复7 9次，驯化富集厌氧 腐殖质还原颗粒污泥；
3、 取富集而得厌氧腐殖质还原颗粒污泥，用超声波破碎，制成菌悬液，再 逐级系列稀释制成菌悬液。
4、 将系列菌悬液接种于融化的固体培养基中，在28-30'C下进行厌氧滚管 法培养，用毛细管将厌氧滚管上长出的橙红色单菌落挑入液体培养基中，在 28-3(TC下厌氧培养7-10天，培养后，再采用厌氧滚管法分离单菌落，如此重复 4 5次，当在显微镜下观察到的细菌细胞形态一致时，获得具有腐殖质呼吸能 力纯菌群。
5、 以液体培养基扩增纯培养物，离心收获菌体细胞，用基本无机盐培养基 制成菌体悬液，添加AQDS，以厌氧条件下将AQDS还原为橙红色的AH2QDS 的能力，判断该菌株是否具有厌氧腐殖质呼吸能力。
6、 根据纯培物的形态特征和分子生物学特征，确定菌株的分类地位，具体 参照文献[12'13]进行。
形态特征包括培养菌落的观察和培养菌体的观察以及菌体细胞结构的观 察。细菌细胞形态观察，按文献[11]介绍的方法染色，采用德国Leica研究显微镜 (DMLB+QCOLite)观察。
比较上述几种实施例，采用不同的碳源及破碎方式不影响具有厌氧腐殖质 呼吸能力的还原菌的富集和分离，但如果培养基中不添加AQDS，则不能富集 厌氧腐殖质还原菌的混培物，也就不能获得具厌氧腐殖质呼吸能力的还原菌的 纯培物。
本发明(实施例1,2,3,4)与对比实验(实施例5)相比，优点是l)可以获 得厌氧腐殖质还原菌的纯培养物(不含污染细胞)，为微生物学研究和工业化应 用提供纯种；2)易探明被分离菌株的生理生化特性，便于菌种保藏和大量扩增； 3)分离、鉴定程序简单，结果可信。
权利要求
1、一种具有厌氧腐殖质呼吸能力还原菌的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤1)选取富含有机质的自然生境和人工生境样品作为具有厌氧腐殖质呼吸能力的还原菌的分离源，自然生境样品是湖泊底泥，人工生境样品是城市污水处理厂厌氧消化池污泥；2)在还原菌的分离源中加入作为富集基质的液体培养基，液体培养基中含有6mM甲酸钠、3mM乙酸钠或1mM葡萄糖，还含有腐殖质模式物蒽醌-2，6-双磺酸盐的基本无机盐液体，每隔5～7天再加入6mM甲酸钠、3mM乙酸钠或1mM葡萄糖和基本无机盐液体，并充氧将橙红色还原态蒽醌-2，6-双磺酸盐氧化为浅黄色的蒽醌-2，6-双磺酸盐，然后用氮气将多余氧气赶出，如此连续重复7～9次，驯化富集厌氧腐殖质还原颗粒污泥；3)取富集而得厌氧腐殖质还原颗粒污泥，用超声波破碎，制成初级菌悬液，再逐级稀释制成系列菌悬液；4)将系列菌悬液接种于融化的固体培养基中，在28-30℃下进行厌氧滚管法培养，用毛细管将厌氧滚管上长出的橙红色单菌落挑入液体培养基中，在28-30℃下厌氧培养7-10天，培养后，再采用厌氧滚管法分离单菌落，如此重复4～5次，当在显微镜下观察到的细菌细胞形态一致时，获得具有腐殖质呼吸能力纯菌群。
2、 根据权利要求1所述的一种具有厌氧腐殖质呼吸能力还原菌的分离纯化 方法，其特征在于，所述的液体培养基配方为NH4Cl 1500mg/L， NaH2PO4600 mg/L， CaCl2 *2H20 100 mg/L， KC1100 mg/L， MgCl2 '6H20 2 mg/L， MnCl2 *41120 5 mg/L， NaMo04 2H20 1 mg/L，蒽醌-2,6-双磺酸盐1 mM。
3、 根据权利要求1或2所述的一种具有厌氧腐殖质呼吸能力还原菌的分离 纯化方法，其特征在于，所述的固体培养基为在上述液体培养基中再添加琼脂 20g/L。
4、 一种具有厌氧腐殖质呼吸能力的还原菌的鉴定方法，其特征在于包括如 下步骤1)将具有腐殖质呼吸能力纯菌群，在5000rpm离心收获菌体细胞，用液体 培养基制成菌体悬液，以厌氧条件下，腐殖质模式物蒽醌-2,6-双磺酸盐还原为橙 红色还原态蒽醌-2，6-双磺酸盐的能力，判断该菌株是否为腐殖质还原菌；2)以菌体形态和16SrDNA序列确定菌株的分类地位，菌体形态包括培养菌 落的观察和培养菌体的观察以及菌体细胞结构的观察，16SrDNA序列的测定步 聚包括提取菌株基因组DNA， PCR扩增16SrDNA，纯化16SrDNA，测定16S rDNA序列，将测得的16S rDNA序列与GenBank (www.ncbi.com)中已有的16S rDNA序列比对，确定菌株的分类地位。
全文摘要
本发明公开了一种具有厌氧腐殖质呼吸能力还原菌的分离纯化及鉴定方法。即以不同碳源作为电子供体，以腐殖质模式物蒽醌-2，6-双磺酸盐作为电子受体，在厌氧条件下驯化富集具有腐殖质呼吸能力的细菌，以还原腐殖质模式物蒽醌-2，6-双磺酸盐的能力作为判据，确认该菌为腐殖质还原菌，并鉴定该菌的分类地位。它采用了一种适合腐殖质还原菌生长的培养基，在基本无机盐培养基中添加甲酸钠或乙酸钠或葡萄糖。先纯化菌株，确认厌氧腐殖质还原能力，再鉴定菌种。本发明获得具有厌氧腐殖质呼吸能力的纯菌群，为微生物学研究和工业化应用提供菌种；探明该菌株的生理生化特性，便于菌种保藏和大量扩增；分离、鉴定程序简单，结果可信。
文档编号C12N1/20GK101307297SQ200710164608
公开日2008年11月19日 申请日期2007年12月21日 优先权日2007年12月21日
发明者徐志伟, 李海波, 沈伟荣, 红 陈 申请人:浙江大学