专利名称：快速纯化及制备细菌pcr反应模板的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及了一种快速纯化及制备细菌PCR反应模板的方法。
背景技术：
PCR技术已广泛应用于病原菌的诊断，具有灵敏度高、特异性强的优点。自然标本中因含有大量的杂菌及异物(包括PCR反应抑制物)，对自然标本中特定病原菌的检测，一般先使用针对该病原菌的特定培养液进行增菌培养，或使用平板(鉴别)培养基进行培养，然后取增菌液或挑取平板培养基中疑似的病原菌菌落，制备PCR反应模板，进行PCR检测。由于自然标本中存在PCR反应抑制物，因此不宜省略增菌培养或鉴别培养的步骤。在整个检测过程中，增菌培养及平板(鉴别)培养耗时费力。本研究以磁性细菌由来的磁珠(bacterial magnetic particles, BMPs)为载体 [K2]，合成免疫BMPs[2、3]，使用免疫BMPs，直接对粪便标本中的大肠杆菌0157进行捕获、分离和洗净，不进行增菌培养及平板(鉴别)培养，探讨快速纯化及制备细菌PCR反应模板的方法。使用免疫BMPs快速纯化细菌PCR反应模板，旨在缩短检测时间，去除自然标本中存在的PCR反应抑制物等影响检测的成分。同时，也可以考虑应用于某些在人工培养基中培养困难的病原菌的PCR反应模板的制备。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单，缩短了检测时间，利用免疫BMPs捕获自然标本(粪便)中的目标病原菌，通过分离和洗净，去除标本中存在的PCR反应抑制物等影响因素，可省略增菌培养及鉴别培养，快速纯化目标病原菌的PCR反应模板的方法。为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决 快速纯化及制备细菌PCR反应模板的方法，包括以下步骤
步骤a 牛粪便标本中添加PBS溶液5 mL,混勻，1000 r/min离心30 s,去除大颗粒的杂质；
步骤b 向含菌的牛粪稀释液中添加免疫BMPs 0. 3 mg,混合均勻，反应30 min后进行磁性诱导，从牛粪中分离出磁性凝集物；
步骤c 分离出来的磁性凝集物使用PBS溶液分散清洗3次，清洗后，添加灭菌双蒸水 100 μ L，分散，重新振荡悬浮后至95°C加热5 min ；再经12000 r/min离心5 min ； 步骤d 回收上清液，制得PCR反应模板。作为优选，所述的PBS溶液的ph值为6. 8。作为优选，所述的磁性诱导采用普通磁石进行诱导。作为优选，所述的牛粪便标本中的大肠杆菌0157浓度为1 IO4 cfu/g。BMI3S系稳定的单磁畴晶体，不同于一般合成磁珠的多磁区构造，在溶液中分散性能明显优于普通铁氧体磁珠，反应表面积相对稳定，检测的敏感性及稳定性较好[1~2]。另外，通常在人工合成的无机磁珠表面进行生物包被或修饰后稳定性欠佳，而BMPs能改善这一现象，大量实验结果均表明修饰后免疫BMPs的稳定性及可操作性良好[2、4、5]。本研究的结果表明，对于大肠杆菌0157浓度为1 IO4 cfu/g的牛粪便标本，使用免疫BMPs处理后制备PCR反应模板，PCR检测结果，与通过增菌及平板培养后制备PCR反应模板，检测结果一致。表明使用免疫BMPs，可以直接对粪便标本中的大肠杆菌0157进行有效捕获、分离和洗净，可省略常规的增菌培养及平板(鉴别)培养，快速纯化细菌的PCR反应模板。在大肠杆菌0157浓度低于IO3 cfu/g时，经免疫BMPs处理后制备PCR反应模板、 及通过增菌和平板培养后制备PCR反应模板，比粪便标本直接制备PCR反应模板，PCR检测的敏感性明显增高。美国农业部动物排泄物病源菌研究实验室的Shelton等[6]报告了一种快速定量及确定自然水体和人工水体中存在的大肠杆菌0157的方法，Shelton等的方法是将大肠杆菌0157的单克隆抗体吸附到人工合成的磁颗粒上，使其与病菌结合，磁性分离后进行培养检测。这种方法可以检出100 mL水中含有的数个大肠杆菌0157，这一方法有助于卫生机构对公共水上场所进行检查。检测粪便等非水溶液的样品标本，在对病原菌的核酸提取过程中，粪便等自然标本中的盐离子、尿素、血红素等诸多混合物共同沉淀其中，成为下一步PCR反应的抑制因素。因此，如何去除自然标本中PCR反应的抑制物，是有效制备DNA模板的关键之一[7]。本研究采用免疫磁分离法，在分离牛粪标本中的大肠杆菌0157时，同时一并去除牛粪标本中可能存在的其他混合物。免疫磁分离法的主要特点是利用外磁场(普通磁石)对标的物进行诱导、分离，还可以对标的物进行清洗，去除自然标本中存在的，包括PCR反应抑制物在内的影响检测结果的各种成分。Padhye等[8]用大肠杆菌0157单克隆抗体研究大肠杆菌0157以外的交叉反应， 未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应，提示单克隆抗体对大肠杆菌0157有明显的特异性，将大肠杆菌0157单克隆抗体包被于磁珠表面，可对标本中低浓度大肠杆菌0157进行磁捕获及分离。使用不同的免疫BMPs，不仅可捕获、分离多种病原菌，还可采用不同抗体、特定受体包被的BMI^s来捕获、分离多种靶细胞[9]°]。此夕卜，也可将BMPs标记核酸探针，用于分离高质量DNA或RNA，尤其适用于分离核酸含量较低的样本[11]。修饰后的免疫Biffs作为特定载体，可与相应抗原发生特异性结合反应，进行特定抗原的捕获、分离和洗净，快速纯化其PCR反应模板。同样，病原菌通过增菌及平板培养后， 挑取疑似的病原菌菌落，制备PCR反应模板，也去除了原标本中的PCR反应抑制物。免疫磁分离法分离的是标本中的原始病原菌，而培养法获取的是由原始病原菌增殖的菌落。对于实验室内培养困难的某些病原菌，可考虑使用经免疫磁分离处理后制备PCR反应模板的方法。本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果
本发明利用免疫BMPs捕获自然标本(粪便)中的目标病原菌，通过分离和洗净，去除标本中存在的PCR反应抑制物等影响因素，可省略增菌培养及鉴别培养，快速纯化目标病原菌的PCR反应模板。本方法操作简单，大大缩短了检测时间，提高了检测效率。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进ー步详细描述 实施例1
1材料和方法 1.1试剂
大肠杆菌0157 vt\,vt2 PCR检测试剂盒为TaKaRa公司产品(One Short PCR Typing Kit Ver. 2) ；PCR所需试剂已全部分装在各离心管内，只需加入反应模板，就能进行PCR反应。检测的目的基因及产物长度为:κ 1:349 bp ;Ki2，Ki2vha，Ki2vhb，Ki2vpl，Ki2vp2:112 bp。从磁性細菌中获取BMPs，将大肠杆菌0157抗体接种于BMPs表面，形成免疫BMPs。BMPs 提取及免疫BMPs的合成见文献[2、3]。大肠杆菌0157抗体及大肠杆菌0157鉴别用平板培养基由TSMERI TECH公司提供。1. 2 标本
本研究使用大肠杆菌0157污染的牛粪标本47份，大肠杆菌0157浓度为1 IO4 cfu/ g ；使用无大肠杆菌0157污染的普通牛粪标本5份。1.3 PCR反应模板
(1)经免疫BMPs处理后制备PCR反应模板取含有大肠杆菌0157的牛粪便标本1 g， 添加Ph值为6. 8的PBS溶液5 mL，混勻，1000 r/min，离心30 s，去除大颗粒的杂质，含菌的牛粪稀释液中添加免疫BMPs 0.3 mg，混合均勻，反应30 min后，将结合了目标病原菌的免疫BMI^s用外磁场(普通磁石)进行磁性诱导，从牛粪中分离出来。分离出来的磁性凝集物使用PBS溶液分散清洗3回。清洗后，结合了目标病原菌的磁性凝集物，添加灭菌双蒸水 100 μ L，分散，重新振荡悬浮后至95°C加热5 min。再经12000 r/min离心5 min。回收上清液，PCR检测用。并且，取无大肠杆菌0157污染的普通牛粪便标本1 g，同样方法进行处理，备測。(2)经增菌及平板培养后制备PCR反应模板增菌培养液组成为(g/L) Tryptone 20, bile salts 1. 12, lactose 5. 0, K2HPO4 4. 0, KHoPOa 1. 5g, NaCl 5. 0, soaium novobiocin:20 mg/L, pH7. 0。取含有大肠杆菌0157的牛粪便标本1 g，添加增菌培养液5 mL，混勻，1000 r/min，离心30 s，去除大颗粒的杂质，含菌的牛粪稀释液，37°C振荡培养12 h。取12 h培养后的增菌液0.1 mL，涂布于大肠杆菌0157平板培养基，37°C恒温培养M h，然后挑取菌落少许，添加灭菌双蒸水100 μ L，分散，重新振荡悬浮后至95°C加热5 min。 再经12000 r/min离心5 min。回收上清液，PCR检测用。(3)标本直接制备PCR反应模板取含有大肠杆菌0157的牛粪便标本1 g，添加 PBS溶液5 mL，混勻，1000 r/min，离心30 s，去除大颗粒的杂质，含菌的牛粪稀释液经5000 r/min离心5 min，弃上清液。沉淀物添加灭菌双蒸水100 μ L，分散，重新振荡悬浮后至 95°C加热5 min。再经12000 r/min离心5 min。回收上清液，PCR检测用。并且，取无大肠杆菌0157污染的普通牛粪便标本1 g，同样方法进行处理，添加PBS溶液5 mL，混勻，1000 r/min，离心30 s，去除大颗粒的杂质，牛粪稀释液经5000 r/min离心5 min，弃上清液。 沉淀物添加灭菌双蒸水100 μ L，分散，重新振荡悬浮后至95°C加热5 min。再经12000 r/ min离心5 min。回收上清液，PCR检测用。1.4 PCR 检测取回收的热变性上清液25 μ L，加入PCR管内，灭菌双蒸水25 yL为阴性对照。于 PCR仪中运行以下程序94°C 1 min，55°C 1 min，72°C 1 min，；35个循环，最后72°C延伸10 min。PCR结束后，取10 μ L PCR产物，添加配套的上样缓冲液1. 5 μ L，于琼脂凝胶中电泳， 紫外透射仪中观察結果。1. 5大肠杆菌0157菌浓度调查
取含有大肠杆菌0157的牛粪便标本1 g，添加PBS溶液2. 5 mL，混勻，取含菌的牛粪稀释液适量，涂布于大肠杆菌0157平板培养基，37°C恒温培养，观察菌落生长并统计菌落数。结果
1.无大肠杆菌0157污染的普通牛粪标本5份，经(1)说明的方法，使用免疫BMPs处理后制备PCR反应模板、以及(3)说明的方法，标本直接制备PCR反应模板，PCR检测结果均为阴性。2. 47份牛粪便标本中，经检测大肠杆菌0157浓度为1 10 cfu/g的12份，大肠杆菌0157浓度为11 IO2 cfu/g的19份，大肠杆菌0157浓度为101 IO3 cfu/g的13 份，大肠杆菌0157浓度为1001 IO4 cfu/g的3份。3.相同的牛粪便标本，分别以(1)使用免疫BMPs处理后制备PCR反应模板、(2) 经增菌及平板培养后制备PCR反应模板、(3)标本直接制备PCR反应模板三种方法制备PCR 反应模板，PCR检测显示κ 及/或vtl基因阳性例的结果见表1。表1 PCR检测显示κ 及/或付2基因阳性例
Table 1 PCR analysis showed that vtl and / or vt2 gene-positive cases
权利要求
1.快速纯化及制备细菌PCR反应模板的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤a 牛粪便标本中添加PBS溶液5 mL,混勻，1000 r/min离心30 s,去除大颗粒的杂质；步骤b 向含菌的牛粪稀释液中添加免疫BMPs 0. 3 mg,混合均勻，反应30 min后进行磁性诱导，从牛粪中分离出磁性凝集物；步骤c 分离出来的磁性凝集物使用PBS溶液分散清洗3次，清洗后，添加灭菌双蒸水 100 μ L，分散，重新振荡悬浮后至95°C加热5 min ；再经12000 r/min离心5 min ；步骤d 回收上清液，制得PCR反应模板。
2.根据权利要求1所述的快速纯化及制备细菌PCR反应模板的方法，其特征在于所述的PBS溶液的ph值为6.8。
3.根据权利要求1所述的快速纯化及制备细菌PCR反应模板的方法，其特征在于所述的磁性诱导采用普通磁石进行诱导。
4.根据权利要求1所述的快速纯化及制备细菌PCR反应模板的方法，其特征在于所述的牛粪便标本中的大肠杆菌0157浓度为1 IO4 cfu/g。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种快速纯化及制备细菌PCR反应模板的方法，将大肠杆菌O157抗体接种于BMPs表面，制成免疫BMPs。使用免疫BMPs，对含有不同浓度大肠杆菌O157的粪便标本，进行目标病原菌的捕获、分离和洗净，再使用洗净的病原菌制备PCR反应模板。本发明利用免疫BMPs捕获自然标本(粪便)中的目标病原菌，通过分离和洗净，去除标本中存在的PCR反应抑制物等影响因素，可省略增菌培养及鉴别培养，快速纯化目标病原菌的PCR反应模板。
文档编号C12N15/10GK102533739SQ20121009510
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者解宇 申请人:杭州师范大学