一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，属于工业微生物技术领域。
【背景技术】
[0002]γ -聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由微生物合成的高分子氨基酸聚合物，其分子链上具有大量的活性较高的游离侧链羧基(-COOH)，具有极高的吸水保湿性，易于和一些药物结合生成稳定的复合物，是一类理想的可生物降解的医药用高分子材料。其对环境无污染，为绿色生物产品，具极佳的生物可降解性、成膜性、成纤维性、可塑性、粘结性、保湿性等许多独特的理化和生物学特性。在注重环保、强调可持续发展的今天，这种由生物合成的可降解型功能材料受到人们的青睐，正逐渐地被应用于医药制造，食品加工，蔬菜、水果、海产品的防冻、保鲜，也可开发应用于化妆品工业，烟草、皮革制造业及植物种子保护等许多领域，是一种有极大开发价值和广阔前景的多功能新型生物制品。
[0003]1942年Bovarnick等人研宄发现芽孢杆菌属细菌能在培养基中积累γ-PGA，由此揭开了微生物发酵法生产γ-PGA的研宄历史。目前，利用微生物发酵法生产γ-PGA—直是人们关注的热点，相关研宄十分活跃。同化学合成法及酶转化法相比，微生物发酵法生产γ-PGA具有生产过程容易控制、发酵产量稳定、提取率高、目标产物产量较高以及产物分子量适宜、环境友好等优点，已逐步成为研宄和生产γ-PGA的主要方法和途径。
[0004]通过微生物发酵得到的高粘度Y -聚谷氨酸发酵液，可通过有机溶剂沉淀法、化学沉淀法和膜分离沉淀法提取γ-聚谷氨酸。(I)有机溶剂沉淀法:一般采用有机溶剂(甲醇或乙醇)沉淀后，通过离心、干燥得到纯品。细胞通过离心从发酵液分离出来，再通过冷冻干燥，加入4倍甲醇放置过夜沉淀离心收集粗品，粗品溶解于蒸馏水，离心去掉不溶性物质。(2)化学沉淀法:化学沉淀法是用饱和硫酸铜、氯化钠溶液代替低级醇类盐析沉淀获取γ-聚谷氨酸。(3)膜分离沉淀法:国内有人选用截留分子量I万的有机膜，取超滤压力
0.06MPa进行膜过滤，也取得较好效果。膜分离技术是一种高效节能型分离技术，大多数膜分离过程在常温下进行，无相变，不产生二次污染。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种简单高效的从发酵液中分离纯化γ -聚谷氨酸的方法，这种方法利用在低PH值发酵液滤液中只有γ-聚谷氨酸沉淀析出的特性，达到了分离纯化高纯度γ-聚谷氨酸的目的。本发明以控制pH值沉淀析出γ-聚谷氨酸的提取工艺为特征，解决了有机溶剂沉淀法提取γ -聚谷氨酸造成的有机溶媒损耗量高、工序长造成的生产成本较高且产品有有机溶剂残留的问题。
[0006]本发明的技术方案是:一种从发酵液中分离纯化γ -聚谷氨酸的方法，其特征是，发酵液用酸调ΡΗ3.0-6.0，过滤除菌，然后用活性炭脱色，再用酸调ρΗ2.0-5.0，静置、析出沉淀，固液分离后用纯化水溶解沉淀得高浓度水溶液，最后经过带式干燥、粉碎得到γ -聚谷氨酸成品。具体步骤如下:
[0007](I)发酵液预处理:将发酵液加热至60-100°C (优选70_90°C )，保温0_2h (优选l-2h)，降温至0-60°C后调pH3.0-6.0 (优选pH3.5-4.0)，通过板框过滤除掉菌体；然后调PH4.0-6.0，加热至60-100°C (优选80-90°C )，加入活性炭并保温脱色O-1h (优选0.5_lh)，脱色结束后板框过滤除活性炭，得到清滤液；
[0008](2)析出沉淀:将清滤液用盐酸调pH2.0-5.0 (优选pH2.5-3.0)，静置0_24h (优选10-24h)，析出沉淀，板框过滤得白色粉末，并用pH2.0-5.0(优选pH2.5-3.0)的纯化水(事先用盐酸调好pH)洗至废水无色澄清为止；
[0009](3)将白色粉末加入纯化水，并调pH3.0-6.0 (优选pH4.0-4.5)，搅拌溶解，得到浓度为20%以上的溶液；
[0010](4)再经过带式干燥、粉碎得到γ-聚谷氨酸成品。
[0011 ] 进一步的，所述步骤5)中带式干燥工艺条件为加热区温度为60-95 V，进样速度为 10-25L/h，履带速度为 5-15cm/min。
[0012]其中，步骤(I)中的发酵液是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FRD518CGMCCN0.6772为生产菌株，通过连续流加补料的方式发酵生产γ -聚谷氨酸，得到的发酵液，其γ_聚谷氨酸产量多65g/Lo具体发酵过程可见本申请人自己的发明专利申请201210555304.5 ;申请日:2012.11.02 ;发明名称:一株产γ -聚谷氨酸基因工程菌及其高产rT _聚谷氨酸方法(见权利要求6及实施例5-6)。
[0013]本发明的机理为:本发明的发明人发现水可溶性的钠型γ-聚谷氨酸在低PH值条件下可转化为水不溶性的氢型γ-聚谷氨酸，而且，经过处理的清滤液中只有γ-聚谷氨酸沉淀析出，可以得到高纯度的γ-聚谷氨酸。利用这个特性对γ-聚谷氨酸提取工艺进行了改进，使γ-聚谷氨酸在常温、无相变的条件下就被分离出来，收率达到85%以上，得到了纯度达到95 %以上、无有机溶剂残留的γ -聚谷氨酸产品。
[0014]本发明提供的一种从发酵液中分离纯化Y-聚谷氨酸的方法，优化了工艺，提高了产品质量，具有如下特点:
[0015]1.以控制pH值沉淀析出Y-聚谷氨酸的提取工艺为特征，彻底取代了有机溶剂沉淀法在提取γ-聚谷氨酸工艺中的应用，解决了有机溶媒损耗量高、工序长造成的生产成本较高的问题；
[0016]2.控制pH值沉淀析出Y-聚谷氨酸的提取工艺很好的将产品和杂质分开，提高了产品收率和纯度，具有在常温下进行、无相变、不产生二次污染、工艺简便的优势；
[0017]3.本发明工艺路线新颖、简单；完全不使用有机溶剂，产品无有机溶剂残留；生产成本低，成本降低30%以上，更适合工业化生产；
[0018]4.最终γ-聚谷氨酸产品纯度达95%以上，总收率达85%以上。产品为白色无定型粉末，质量指标已达到化妆品级的要求。
【具体实施方式】
[0019]本实施例的发酵液为采用专利申请201210555304.5中的发酵方法，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FRD518CGMCC N0.6772为生产菌株，通过连续流加补料的方式发酵生产γ-聚谷氨酸得到的发酵液，其γ-聚谷氨酸产量为67.5g/L。
[0020]实施例1:
[0021](I)发酵液预处理:将发酵液加热至90°C，保温lh，降温至60°C后调pH4.0，通过板框过滤除掉菌体，然后调PH5.0，加热至80°C，加入活性炭并保温脱色lh，脱色结束后板框过滤除活性炭，得到清滤液；
[0022](2)析出沉淀:将清滤液用盐酸调pH2.5，静置24h、析出沉淀，板框过滤得白色粉末，并用pH2.5的纯化水洗至废水无色澄清为止；
[0023](3)将白色粉末加入纯化水，并调pH4.0，搅拌溶解，得到浓度为30%的溶液；
[0024](4)再经过带式干燥(带式干燥工艺条件为加热区温度为75_85°C，进样速度为15-20L/h，履带速度为lOcm/min)、粉碎得到γ -聚谷氨酸成品，纯度为96.5%，总收率
87.
[0025]实施例2:
[0026](I)发酵液预处理:将发酵液加热至75°C，保温2h，降温至60°C后调pH3.5，通过板框过滤除掉菌体，然后调PH6.0，加热至85°C，加入活性炭并保温脱色0.5h，脱色结束后板框过滤除活性炭，得到清滤液；
[0027](2)析出沉淀:将清滤液用盐酸调pH 3.0，静置12h、析出沉淀，板框过滤得白色粉末，并用pH3.0的纯化水洗至废水无色澄清为止；
[0028](3)将白色粉末加入纯化水，并调pH 4.5，搅拌溶解，得到浓度为40%的溶液；
[0029](4)再经过带式干燥(带式干燥工艺条件为加热区温度为75_85°C，进样速度为15-20L/h，履带速度为lOcm/min)、粉碎得到γ -聚谷氨酸成品，纯度为95.9%，总收率
88.
[0030]实施例3:
[0031](I)发酵液预处理:将发酵液加热至80°C，保温1.5h，降温至60°C后调pH4.0，通过板框过滤除掉菌体，然后调PH6.0，加热至85°C，加入活性炭并保温脱色0.5h，脱色结束后板框过滤除活性炭，得到清滤液；
[0032](2)析出沉淀:将清滤液用盐酸调pH 2.5，静置18h、析出沉淀，板框过滤得白色粉末，并用pH2.5的纯化水洗至废水无色澄清为止；
[0033](3)将白色粉末加入纯化水，并调pH 4.5，搅拌溶解，得到浓度为35%的溶液；
[0034](4)再经过带式干燥(带式干燥工艺条件为加热区温度为75_85°C，进样速度为15-20L/h，履带速度为lOcm/min)、粉碎得到γ -聚谷氨酸成品，纯度为96.2%，总收率88.
【主权项】
1.一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，发酵液用酸调ΡΗ3.0-6.0，过滤除菌，然后用活性炭脱色，再用酸调ρΗ2.0-5.0，静置、析出沉淀，固液分离后用纯化水溶解沉淀得高浓度水溶液，最后经过带式干燥、粉碎得到γ -聚谷氨酸成品。
2.如权利要求1所述的一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是， (1)发酵液预处理:将发酵液加热至60-100V，保温0-2h，降温至0-60 V后调PH3.0-6.0，通过板框过滤除掉菌体；然后调pH4.0-6.0，加热至60_100°C，加入活性炭并保温脱色Ο-lh，脱色结束后板框过滤除活性炭，得到清滤液； (2)析出沉淀:将清滤液用盐酸调PH2.0-5.0，静置0-24h，析出沉淀，板框过滤得白色粉末，并用PH2.0-5.0的纯化水洗至废水无色澄清为止； (3)将白色粉末加入纯化水，并调pH3.0-6.0，搅拌溶解，得到浓度为20%以上的溶液； (4)再经过带式干燥、粉碎得到γ_聚谷氨酸成品。
3.如权利要求2所述的一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述步骤(I)发酵液预处理为:将发酵液加热至70-90°C，保温l_2h，降温至0-60°C后调PH3.5-4.0，通过板框过滤除掉菌体；然后调pH4.0-6.0，加热至80-90°C，加入活性炭并保温脱色0.5-lh，脱色结束后板框过滤除活性炭，得到清滤液。
4.如权利要求2所述的一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述步骤(2)析出沉淀为:将清滤液用盐酸调ρΗ2.5-3.0，静置10-24h，析出沉淀，板框过滤得白色粉末，并用PH2.5-3.0的纯化水洗至废水无色澄清为止。
5.如权利要求2所述的一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述步骤(3)白色粉末加入纯化水，并调ρΗ4.0-4.5，搅拌溶解，得到浓度为20%以上的溶液。
6.如权利要求2-5中任意一项所述的一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述步骤5)中带式干燥工艺条件为:加热区温度为60-95?，进样速度为10-25L/h，履带速度为 5-15cm/min。
【专利摘要】本发明公开了一种从发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的方法。它利用在低pH值发酵液滤液中只有γ-聚谷氨酸析出的特性，达到了分离纯化高纯度γ-聚谷氨酸的目的。具体工艺为：用酸调pH3.0-6.0，过滤除菌，然后用活性炭脱色，再用酸调pH2.0-5.0，静置、析出沉淀，固液分离后用纯化水溶解沉淀得高浓度水溶液，最后经过带式干燥、粉碎得到γ-聚谷氨酸成品。本发明工艺路线新颖、简单；完全不使用有机溶剂，产品无有机溶剂残留；生产成本低，成本降低30％以上；收率高，达到85％以上；产品品质好，纯度达到95％以上，更适合工业化生产。
【IPC分类】C08G69-10
【公开号】CN104804183
【申请号】CN201510193843
【发明人】张林军, 苏移山, 马双双, 朱云峰, 宗工理, 李珍爱, 刘英梅, 赵文刚
【申请人】山东福瑞达生物科技有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月21日