一种高产果胶酶菌株及其应用的制作方法

文档序号:11230010

本发明属于微生物技术领域,具体地说,涉及一种高产果胶酶菌株及其应用。



背景技术:

果胶酶是一种能分解果胶的一种复合酶的总称。果胶酶主要包含原果胶酶(protopectinase)、果胶甲酯酶(Pectin esterase,PE)、果胶裂解酶(Pectinlyase,PL)、聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases,PG)、纤维素酶(cellulose)等。原果胶酶(protopectinase)能够将不溶性的原果胶水解成为水溶性的果胶,从而切断阿拉伯糖和聚甲氧基半乳糖醛酸之间的化学键;果胶裂解酶(PL)可使长链分子的果胶链断裂,形成众多短链分子的果胶;果胶甲酯酶(PE)和聚半乳糖醛酸酯酶(PG)的主要功能作用是将短链果胶水解成更小的分子,使其凝聚并沉降分离;纤维素酶可降低粘度,增加内源酶的扩散,提高酶与其它成分的接触面积,促进果胶等大分子物质的分解。

由于葡萄中含有大量果胶会导致澄清困难、出汁率低、过滤效率差等问题。且在葡萄浸渍过程中,这些存在于葡萄皮和果肉中的大量果胶也会阻碍色素和单宁的浸提、溶解和稳定,从而增加葡萄酒酿造的难度。因此,在适当工艺阶段添加果胶酶后,果胶将被较为彻底地分解,使得葡萄汁澄清和过滤更为容易,同时大大提高出汁率,从而提高自流酒产量。目前有关果胶酶的研究主要集中于产酶菌种的筛选、酶的提取分离以及提高果汁出汁率和澄清方面。

遗憾的是,目前我国葡萄酒工业中所用的果胶酶几乎被德国、法国、意大利、丹麦、荷兰、日本和西班牙等国的酶制剂公司垄断。显然,与国外相比,我国在该领域的工作无论是理论深度,还是应用开发都存在不小的差距。随着我国葡萄酒和其它果酒果汁业的迅猛发展,国内对果胶酶的需求量也呈上升趋势。因此,尽快推出拥有自主知识产权、低成本、活力高,稳定性好,专一性强的果胶酶制剂是我国葡萄酒行业亟需解决的问题。



技术实现要素:

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷,提供一种高产果胶酶菌株及其应用,实现了从葡萄园土壤中筛选得到了高产果胶酶且酶活高的菌株,保证了果胶酶的有效生产,也做到了产量的提高。

其具体技术方案为:

一种高产果胶酶菌株,所述菌株命名为塔宾曲霉Rn14-88A(Aspergillus tubingensis Rn14-88A),该菌株,已于2016年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.13184。

进一步,所述菌株的核苷酸序列如SEQ:ID:NO:1所示。

本发明所述高产果胶酶菌株在果胶酶制剂制备过程中的应用。

与现有技术相比,本发明的有益效果为:

本发明的塔宾曲霉Rn14-88A可以高产果胶酶,该果胶酶酶活的最适pH在3-4左右,非常适合葡萄酒的环境。这种果胶酶具有可以应用于葡萄酒发酵生产中的潜力。

本发明的塔宾曲霉Rn14-88A可采用液态发酵生产果胶酶,该生产过程涉及到种子的培养、液体发酵及相关的后处理工作。所采用的液体发酵培养基原料来源成本低,操作工艺简单。因此,该高产果胶酶菌株具有生产成本低,产品酶活高的特点。

本发明的塔宾曲霉Rn14-88A是从葡萄园土壤中筛选得到,塔宾曲霉为国家卫生部和FDA公布的食品安全菌株,不存在任何安全性隐患。因此,本发明的塔宾曲霉用于制备葡萄酒用果胶酶安全可靠。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

下例实施中,如无特殊说明,无菌均为高温杀菌(121℃,20min)。

下列实施中富集培养基配方如下:

果胶2g·L-1、硫酸铵3g·L-1、磷酸二氢钾1.4g·L-1、十二水合磷酸氢二钠4.2g·L-1、七水合硫酸亚铁0.01g·L-1、七水合硫酸镁0.5g·L-1、琼脂20g·L-1

下列实施中的基础培养基配方如下:

桔皮粉20g·L-1、蛋白胨5g·L-1、七水合硫酸镁1g·L-1、氯化钠1g·L-1、三水合磷酸氢二钾1g·L-1、磷酸二氢钾0.5g·L-1

下列实施中固体培养基配方如下:

桔皮粉20g·L-1、蛋白胨5g·L-1、七水合硫酸镁1g·L-1、氯化钠1g·L-1、三水合磷酸氢二钾1g·L-1、磷酸二氢钾0.5g·L-1、琼脂20g·L-1

一、高产果胶酶菌株塔宾曲霉Rn14-88A的获得

1、菌株的初筛

将从葡萄园中取回的土壤称取10g于100mL的三角瓶中,加入90mL无菌生理盐水,通过磁力搅拌器搅拌30-40min,搅拌均匀后静置澄清,吸取20μL的澄清液均匀涂布于富集培养基平板上,每个样分别做10个平行,在27-30℃的培养箱中培养5-7天。将平板上长出的各种霉菌分别用无菌牙签挑取单菌落于新的富集培养基平板上,在27-30℃的培养箱中培养3-7天。重复单菌落纯化的操作,直至每个平板上长出的菌落为纯种单菌落为止。将生长出来的单菌落转接到斜面培养基上生长10天左右。将转接前的单菌落平板用3-5mL卢戈氏碘液(2g碘化钾,1g碘,用蒸馏水定容至300mL)染色10-30min,观测单菌落的透明圈直径Dp与菌落直径Dc。挑选出Dp/Dc比值较大的菌株为初筛菌株。将所得所有菌株保存于甘油冻存管中(装有浓度为20%的无菌甘油),置于-40℃冰箱中保存。

2、菌株的复筛

将初筛得到的菌株分别接种于基础发酵培养基中,30℃,160rpm振荡活化培养2天。将活化后的菌株分别转接到250mL的三角瓶中的基础培养基中,30℃,160rpm振荡培养2天。将扩大培养的菌株发酵液分别于9000rpm,4℃,15min离心,取上清液作为粗酶液,取1mL用作检测。通过检测各个菌株的果胶酶活力,最终获得酶活较高的塔宾曲霉Rn14-88A,酶活为8363.215U/mL。塔宾曲霉Rn14-88A,已于2016年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.13184。

3、果胶酶酶活力测定方法

采用酶标仪测定。果胶酶酶活的定义:单位时间内每1mL粗酶液水解底物生成1mg半乳糖醛酸的能力,定义为一个酶活单位(U)。果胶酶酶活测定条件为:将发酵液于9000rpm,4℃,离心15min,上清液即为粗酶液,取1mL用作检测。果胶酶检测反应体系:含1%果胶(底物)的柠檬酸缓冲液(pH5.0)2mL。果胶酶检测的反应条件为:将反应体系置于50℃的水浴锅中恒温水浴6min,水浴加热后分别加入稀释两倍的待测样品200μL(灭活的酶液为空白对照),充分反应30-40min,再加入3mLDNS(3.25g 3,5-二硝基水杨酸,2moL·L-1氢氧化钠162.5mL,22.5g丙三醇,用蒸馏水定容至500mL)试剂,于水浴锅中沸水浴10min后加蒸馏水定容,在562nm处测定吸光值。

4、霉菌菌株的鉴定

该菌株在富集培养基上培养5天后,菌落直径达6-8mm,菌落初期为白色,后逐渐变为浅黄色,最后变为黄褐色,边缘圆形、整齐;菌落正面有大量孢子,暗黄色,无渗出液;菌落的背面略显浅黄色。

塔宾曲霉Rn14-88A的ITS鉴定结果如下:

内转录间隔区1和2序列(578bp):

ACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGTCTATTATACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTTTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT。

与相关模式菌株塔宾曲霉F43-02相似性:100%,鉴定为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)。

二、塔宾曲霉Rn14-88A的产酶特性

按上述步骤3“果胶酶酶活力测定方法”进行发酵产物的酶活测定,该塔宾曲霉Rn14-88A可同时产多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶裂解酶(PL)、果胶甲酯酶(PE)、纤维素酶,且酶活力均较高。

由于果胶酶为复合酶,因此,本发明所测试的酶反应最适反应条件为复合酶的最适反应条件。经检测,其适宜反应温度范围为45-55℃,最适反应温度为50℃。适宜的pH作用范围是2.8-5.5,最适反应的pH为3左右。综上所述,塔宾曲霉Rn14-88A所产果胶酶的最适反应温度为50℃和pH为3.0,适合葡萄酒生产使用。

三、塔宾曲霉Rn14-88A在制备葡萄酒用果胶酶的应用

1、液态发酵塔宾曲霉Rn14-88A制备葡萄酒用果胶酶

将塔宾曲霉Rn14-88A以桔皮粉为主要原料发酵生产果胶酶,其主要发酵方法是:

(1)种子液的获得,将原始保存于甘油冻存管中的霉菌菌株200μL接种于装有6mL无菌基础发酵培养基中30℃,160rpm振荡活化培养40小时获得种子液。

(2)液态发酵

将上述所获得的种子转接到250mL装有50mL无菌基础发酵培养基三角瓶中,30℃,160rpm振荡活化培养2天得扩大培养产物。

(3)液态发酵产物的获得

将上述所得扩大培养产物转入50mL离心管中,9000rpm,4℃,离心15min,上清液即为粗酶液。

(4)产品处理

将浓度为50%的无菌琼脂(50g琼脂,加蒸馏水定容至100mL)溶液冷却至不凝固的适当温度,按4%的比例缓慢加入步骤(3)所获得酶液并迅速混匀,待完全冷却凝固后即得到固体发酵产物。将上述获得的固体发酵产物在65℃的烘干箱中烘干,粉碎,得到发酵产物葡萄酒用果胶酶。

以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的保护范围不限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均属于本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种高产果胶酶菌株及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 578

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acctgcggaa ggatcattac cgagtgcggg tcctttgggc ccaacctccc atccgtgtct 60

attataccct gttgcttcgg cgggcccgcc gcttgtcggc cgccgggggg gcgcctttgc 120

cccccgggcc cgtgcccgcc ggagacccca acacgaacac tgtctgaaag cgtgcagtct 180

gagttgattg aatgcaatca gttaaaactt tcaacaatgg atctcttggt tccggcatcg 240

atgaagaacg cagcgaaatg cgataactaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga 300

gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat 360

tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gtcgccgtcc ccctctccgg ggggacgggc 420

ccgaaaggca gcggcggcac cgcgtccgat cctcgagcgt atggggcttt gtcacatgct 480

ctgtaggatt ggccggcgcc tgccgacgtt ttccaaccat tttttccagg ttgacctcgg 540

atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaat 578

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