一种产纤维素酶微生物菌株及其在烟草中的应用的制作方法

文档序号:12411021阅读:885来源:国知局
本发明涉及一种产纤维素酶微生物菌株及其在烟草中的应用,属于微生物发酵及应用领域。
背景技术
:纤维素是烟叶的主要结构成分,决定着烟叶完整性;纤维素对烟叶燃烧性有促进作用,可增加烟叶持火力。但是,烟叶中纤维素含量过高时会使烟叶组织粗糙,容易破碎;并且烟草配方中高纤维素含量一般对燃吸品质具有副作用,赋予烟气一种尖刺的刺激性,低次烟叶纤维素含量较高,烟气涩口且枯焦气和木质气重。据推测,低次烟叶的纤维素含量要高于优质烟叶。据研究表明:纤维素在300-500℃范围内热解,主要生成了2,5-二甲基呋喃、5-甲基糠醛、1,6-脱水-β-吡喃葡萄糖和5-羟甲基糠醛;在500-600℃,主要生成了苯乙酮、2-甲基苯并呋喃、甲基儿茶酚、甲苯和苯等;超过600℃,主要热解生成稠环芳烃(PAH),如荼酚、荼、蒽、荧蒽等。其中,酚类是纤维素热解产物的主要成分,这些化合物的吸味与带有烟熏气味的食品香料类似;吡喃葡萄糖及其他类似的化合物具有抽烟时焦糖样的特征香气和吸味;稠环芳烃(PAH)有致癌作用,降低烟叶中的纤维素含量不仅可以改善烟叶品质,且能降低烟气中的有害成分。目前的专利技术多集中在利用商品化的纤维素酶及多酶复合体处理烟叶或梗丝,以改善品质,如中国专利CN102631021A;或者利用产纤维素酶的真菌及发酵液处理烟草,如中国专利CN105907649A。本发明在于提供一种产纤维素酶的微生物及其发酵液在烟草中的应用方法。技术实现要素:本发明的目的在于提供一种产纤维素酶的微生物及其发酵液在烟草中的应用方法。本专利申请人从片烟中分离、鉴定出一种具有分泌纤维素酶能力的短小芽孢杆菌菌株TX1,该菌株TX1保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2016年7月5日,分类命名为BacilluspumilusTX1,保藏编号为:CCTCCNO:M2016377,保藏地址为中国武汉武汉大学。用产纤维素酶短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)TX1菌株发酵液处理烟丝或片烟,能够显著地降低烟草纤维素含量,改善吸食品质。另外,该微生物菌株发酵液还可以降低烟梗中纤维素含量。短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)TX1为革兰氏阳性菌株,在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上生长快速,菌落呈白色,菌落表面有褶皱,中央为形状不规则的突起。本发明是利用BacilluspumilusTX1菌株经摇瓶发酵所得发酵粗酶液处理烟叶或烟梗,从而达到降低烟草纤维素含量,改善烟草品质的目的,本发明主要内容如下:(1)菌悬液制备:在无菌的条件下,将BacilluspumilusTX1菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上,经培养后加入5mL无菌水制备菌悬液。(2)摇瓶培养:将菌悬液接种至装有发酵培养基的三角瓶中进行发酵培养。(3)发酵液处理:在室温(25℃-28℃)下,将发酵液离心,得到上清液即为粗酶液。(4)利用TX3菌株经摇瓶发酵所得粗酶液处理片烟或烟丝,能够明显降低烟草中所含纤维素含量。本发明具体实施过程为:(1)菌悬液制备:在无菌条件下,将BacilluspumilusTX1菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上,培养基量为试管体积的1/4左右为宜。菌株在30℃下生长24h后,加入5mL左右的无菌水,振荡得到菌悬液。菌株适宜的生长温度为25℃-37℃,适宜的培养时间为12h~72h。(2)摇瓶培养:将孢子悬液以体积浓度1%-10%的接种量接种至装有100mL发酵培养基的三角瓶(250mL)中进行发酵培养。培养温度为30℃,摇床转速为150rpm,培养时间24h-96h。发酵培养基组成是(g/L):马铃薯200,葡萄糖20,自然pH。(3)发酵液处理:在室温条件(25℃-28℃)下,将所得发酵液于0℃-4℃、3000-10000rpm条件下离心5min-10min,得到上清液极为粗酶液。(4)烟叶处理及烟叶中纤维素含量测定:称取10g烟叶,将步骤(3)制备的200/mL纤维素酶液与所需补加的水分混匀,用小型喷雾器均匀喷施于烟叶表面。将喷施纤维素酶的烟叶用塑料袋包装,置于恒温培养箱中,50℃,pH4.8,湿度40%处理3h。处理结束后,迅速放入80℃烘箱中,保持20min,使酶灭活。将酶解后的烟叶浸泡在水中,测水溶液中的还原糖含量变化。上述粗酶液纤维素酶活力测定:准确称量50mgWhatmanNo.1碎滤纸条于10mL具塞试管中;加入1.0mLpH4.8的0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液到上述试管中,缓冲液浸没滤纸条;将装有柠檬酸缓冲液和底物的试管置于50℃水浴锅中;添加0.5mL合适的酶稀释液(用柠檬酸缓冲液稀释),准备五组酶稀释液样品,使得释放出的葡萄糖在5mg左右;在50℃水浴锅中反应60min;反应完毕后,从50℃水浴锅中取出,立即加入3.0mLDNS混匀终止反应。以灭活酶液为对照,在540nm下测定吸光度值,根据葡萄糖标准曲线计算还原糖含量。纤维素酶活力:在上述反应条件下,每分钟内将1微摩尔的滤纸转化为还原糖的酶量定为1个单位,以U/mL表示。烟草中纤维素含量的测定按照张槐苓等介绍的方法进行(张槐苓,葛翠英,穆怀静等.烟草分析与检测[M].郑州:河南科学技术出版社,1994:103-111)。与现有技术相比,本发明的优点为:本发明从片烟中筛选具有产纤维素酶能力的菌株,经发酵后应用于烟草中,可保证菌株来源的安全性及与烟草作用的特异性,能够有效降低烟叶(或烟梗)纤维素含量,从而降低烟气中所含有害物质。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。以下实施例中的试验,均设置三次重复,结果取平均值。实例1在20mL体积的试管中加入5mL的马铃薯葡萄糖琼脂培养基制成斜面,将BacilluspumilusTX1产纤维素酶菌株接种于斜面上30℃培养48h,加入5mL无菌水,振荡得到孢子悬液。将孢子悬液以体积浓度5%的比例接种至装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中进行发酵培养。培养温度30℃,摇床转速150rpm,培养时间48h。发酵液在4℃、6000rpm条件下离心,得到上清液即为粗酶液。经过试验测定,所得粗酶液纤维素酶活力为70.1U/mL。发酵培养基组成为(g/L):马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,自然pH。称取10g烟叶,加200U/ml纤维素酶液与所需补加的水分混匀,用小型喷雾器均匀喷施于烟叶表面。将喷施纤维素酶的烟叶用塑料袋包装,置于恒温培养箱中,50℃,pH4.8,湿度40%处理3h。处理结束后,迅速放入80℃烘箱中,保持20min,使酶灭活。将酶解后的烟叶浸泡在水中,测水溶液中的还原糖含量变化。取出少量样品45℃烘干后测定纤维素含量及烟叶化学成分。纤维素及还原糖含量测定结果见表1,烟草化学成分测定结果见表2。表1纤维素酶对烟叶中纤维素及总糖含量的影响处理纤维素/%还原糖/%对照13.2723.57粗酶液9.4725.61由表1可以看出,经过发酵粗酶液处理后,烟叶纤维素含量明显降低。未经处理样品纤维素含量为13.27%,添加粗酶液处理后样品纤维素含量为9.47%,与空白对照相比较降低了28.64%;与对照相比,加酶处理后的还原糖含量升高,升高幅度为8.66%。由此可见,本发明BacilluspumilusTX1菌株发酵粗酶液能够有效降低烟叶纤维素含量。表2烟草常规化学成分测定结果处理对照粗酶液烟碱/%2.031.96总氮/%1.691.61淀粉/%8.577.74K/%1.991.91表2列出了粗酶液的使用对烟叶其他化学成分的影响。从表2可以看出,烟碱、总氮及淀粉含量呈现下降趋势,降幅分别为3.44%、4.73%及9.68%;K含量比对照略有增加。以上结果说明,发酵粗酶液可有效降低纤维素含量,同时提高烟叶所含糖量,并且能够保持烟叶各化学成分指标之间的协调性,有利于提高烟叶的使用价值。当前第1页1 2 3 
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